Este protocolo descreve a preparação e transformação do competente E. coli DH5α utilizando uma adaptação do procedimento de cloreto de cálcio (12).

1. Configuração

1. Equipamento
   • Espectrofotômetro
   • Centrífuga de Sorval (ou equivalente)
   • Centrífuga benchtop
   • Bloco de calor ou banho de água
   • Orbital Shaker
   • Incubadora Estacionária
   • Bandeja de fundição de gel
   • Bem pentes
   • Fonte de tensão
   • Caixa de gel
   • Fonte de luz UV
   • Microondas
2. Soluções e reagentes
   • Caldo luria-bertani (LB) (10 g de hidrolise enzimática de caixa, extrato de levedura de 5 g e cloreto de sódio de 5 g em 1000 mL de H₂O)
   • Caldo super ideal com repressão catabólica (SOC): (2% (w/v) triptona, extrato de levedura de 0,5% (w/v), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl_2,10 mM MgSO₄e 20 mM de glicose)
   • CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) solução.
   • Solução M CaCl₂ (se as células serão transformadas imediatamente) ou solução de 0,1M CaCl₂ contendo 10% (v/v) glicerol (se as células serão congeladas para uso futuro).
   • Placas de ágar LB
   • Placas seletivas de ágar LB (para este experimento, uma vez que o plasmid usou resistência à ampicilina, foram utilizadas placas de ágar LB contendo ampicillin 100 μg/mL)
   • E. coli Tensão DH5α
   • DNA plasmid pUC19 (100 pg/ μl)
   • QiAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)
   • Hind Enzima de restrição III
   • 1 kb mais escada de DNA
   • Ponto de fusão baixo Agarose
   • Tampão TAE 1X (Base Tris de 40 mM, ácido acético de 20 mM e 1mM EDTA)
   • Brometo de ethidium (10mg/mL)
3. Notas gerais de segurança
   E. coli DH5α é classificado como Biossegurança Nível 1 (BSL1). Micróbios nesta categoria representam pouca ou nenhuma ameaça de infecção em adultos saudáveis. No entanto, é necessária uma manipulação cuidadosa do microrganismo.

IMPORTANTE todas as etapas deste protocolo precisam ser realizadas utilizando técnicas assépticas e em temperaturas de gelo ou 4°C, a menos que indicado.

2. Protocolo

1. A partir de um estoque congelado de E. coli DH5α (congelado em 20% de glicerol de uma cultura durante a noite cultivada em LB) listram bactérias para isolamento em uma placa de ágar LB. Incubar a 37°C durante a noite (16-20 horas).
2. Inocular uma única colônia em 3 mL de caldo LB em um tubo. Cresça tremendo a 210 rpm a 37°C durante a noite (16-20 horas).
3. Meça o OD600 da cultura da noite para o dia. Use a cultura da noite para inocular 100 mL de caldo LB em um frasco de 1 litro para um OD600 =0,01. Incubar a cultura tremendo vigorosamente (210 rpm) a 37°C monitorando OD600 no espectrofotômetro a cada 15-20 min, até que a cultura atinja OD600=0,35 (aproximadamente 3 horas).
   NOTA: Para que a transformação seja eficiente, as células bacterianas precisam estar em fase de crescimento exponencial médio. O número máximo de células precisa ser de 10⁸ células/mL, o que para a maioria das cepas de E. coli corresponde a OD600 =0,4. O uso do espectrômetro permite medir o OD600, que permite determinar que as células estão no estágio de crescimento adequado. Se este protocolo for usado para outras cepas de bactérias, a calibração para determinar o número de colônias formando unidades em valores específicos de OD600 será necessária para determinar essa correlação.
4. Transfira os 50 mL da cultura para cada uma das 2 garrafas de centrífugas de polipropileno geladas. Coloque as garrafas no gelo por 20 minutos para esfriar.
5. Recupere as células por centrifugação a 2700g (4100 rpm em um rotor Sorval GSA) por 10 min a 4°C.
6. Remova o supernatante. Escorra os últimos traços da mídia colocando a garrafa de cabeça para baixo em um bloco ou papel toalha.
7. Resuspenda cada pelota bacteriana em 30 mL de uma solução gelada CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) solução gelada. Primeiro adicione 5 mL da solução, gire cuidadosamente até que a pelota tenha dissolvido completamente e, em seguida, adicione os 25 mL restantes da solução.
8. Repita o passo 2.4.
9. Repita o passo 2.5.
10. Se as células competentes forem diretamente transformadas, resuspenncie cada pelota bacteriana em 2 mL de uma solução gelada cacl₂ (0,1 M) girando os tubos cuidadosamente. Se a pelota não ficar ressuspendida com este método, resuspend por tubos suavemente para cima e para baixo (evitando a formação de bolhas).
    Alternativamente, as células competentes podem ser congeladas e armazenadas para uso posterior. Para preparar estoques congelados de células competentes, resuspense a pelota em 2 ml de uma solução 0.1M CaCl₂ contendo 10% (v/v) glicerol. Esta solução precisa ser gelada. Suspensão de células de aliquot em tubos de polipropileno gelado de 1,5 mL (160 μl por tubo). Congele as células competentes imediatamente em um banho seco de gelo/etanol. Transfira os tubos para um congelador de -70°C.
11. Para transformar as células tratadas com CaCl_2,transfira 50 μl de células competentes para cada um dos tubos de polipropileno de 2,5 ml. Adicione os 1 μl (100 pg) de DNA plasmídeo pUC19 a um dos tubos e deixe o segundo tubo sem DNA (controle negativo). Misture suavemente (evite a formação de bolhas). Incubar por 30 minutos no gelo.
    NOTA: Não mais de 50 ng de DNA em um volume de 10 μL ou menos deve ser usado na transformação.
12. Transfira os tubos para o bloco de calor e incubar a 42°C por 45 s exatamente.
    NOTA: O choque térmico é um passo crítico. Não exceda a temperatura ou o tempo de incubação.
13. Transferência prontamente de tubos para gelo. Incubar por 2 min.
14. Adicione 950 μL de mídia SOC e incubar os tubos por 1 hora a 37°C para permitir que as bactérias se recuperem e expressem o marcador resistente a antibióticos codificado no plasmídeo.
15. Diluir 10 μL da suspensão celular em 1000 μL em SOC (diluição de 1/100) e 100 μL da suspensão celular em 1000 μL em SOC (diluição de 1/10). Placa 100 μl das diluições, bem como o controle, em placas seletivas, e espalhar usando uma espátula. Normalmente, o revestimento de 100 μL de uma diluição de 1/100 e 1/10 produzirá número suficiente de unidades formadoras de colônias (cfu) por placa. Idealmente, esse número deve variar entre 30-300 cfu para que haja colônias suficientes, mas separadas umas das outras. No entanto, o número de cfu dependerá da eficiência de transformação (ver Seção de Análise de Dados e Resultados).
16. Incubar as placas a 37°C. Colônias transformadas devem aparecer em 12-16 horas (essa faixa dependerá da cepa celular e método de seleção). Nenhuma colônia deve crescer no controle negativo.
17. Conte a cfu/placa obtida para a transformação (Tabela 1).
18. Para verificar se serão realizados os transformadores do plasmídeo pUC19, será realizada uma preparação plasmida e posterior digestão. Para isso, inocular uma única colônia em 3 ml de caldo LB em um tubo. Cresça tremendo a 210 rpm a 37°C durante a noite (16-20 horas).
19. Prepare uma preparação plasmida usando o Kit Miniprep QIAprep Spin, de acordo com as instruções do fabricante.
20. Digerir os 1 μg de pUC19 purificado com a enzima de restrição HindIII a 37°C por 1 hora.
    NOTA: Qualquer enzima que corte no local de clonagem múltipla pUC19 pode ser usada para esta etapa.

21. Execute uma escada de peso molecular, DNA pUC19 digerido e a mesma quantidade de DNA pUC19 não digerido em um gel de 1% de agarose contendo 1 μg/mL brometo de etídio por 1 hora a 95 V.
    NOTA: o tempo e a tensão variam dependendo do equipamento utilizado.
22. Visualize o gel sob a luz UV. Compare o tamanho do DNA pUC19 digerido e não digerido(Figura 2) (ver Seção de Análise de Dados e Resultados).
    Prossiga com as etapas necessárias para verificar a transformação de acordo com o objetivo de cada experimento de transformação em particular.

Figura 2: Digestão do DNA plasmídeo recuperado das células DH5α transformadas. O DNA plasmídeo foi recuperado de células DH5α transformadas, digeridas com HindIII, executadas em um gel de 1% de agarose e visualizadas com uma fonte UV (passos 2,19 a 2,22).

3. Análise e Resultados de Dados

Para calcular a eficiência da transformação, um indicador de quão bem as células ocuparam o DNA extracelular, as colônias obtidas na transformação precisam ser contadas:

Tabela 1: Unidades formadoras de colônias (cfu) contaram a partir de experimento de transformação.

A eficiência de transformação (TE) é uma medida do número de cfu resultante da transformação de 1 μg de plasmídeo em um determinado volume de células competentes. Muitos parâmetros afetam a eficiência de transformação: tamanho plasmídeo, genótipo celular, estágio de crescimento durante a preparação de competências, métodos de transformação, etc.). Ao calcular o TE é importante considerar qual diluição (se houver) foi realizada antes do emplacamento e incorporá-la no cálculo do número total de cfu. A eficiência de transformação (TE) é calculada com a seguinte equação:

Primeiro divida a cfu pelo μg de DNA, neste exemplo 0,0001μg. Em seguida, divida o resultado pelo fator de diluição. Neste exemplo, foi utilizada uma diluição de 1/10 e 100μL de uma solução de 1 ml (diluição: 1/10 × 100 μL /1000 μL=0,01).