Este trabalho foi financiado por concessões do CIHR e NSERC do Canadá. VIT é um CIHR New Investigator e Concordia University, em Cátedra de Investigação Genómica, Biologia Celular e Envelhecimento.

Materiais e métodos Cepas de leveduras e condições de crescimento A cepa do tipo selvagem BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) foi cultivado em meio YEPD rica (1% extrato de levedura, peptona 2%, 2% de glicose). Células foram cultivadas a 30 ° C com rotação agitação a 200 rpm em Erlenmeyers em um &quot;volume frasco de volume / médio&quot; proporção de 5:1. Isolamento da fração mitocondrial crude <ol><li> Crescer 1 L da cultura BY4742 tipo selvagem tensão por 48 h. </li><li> Despeje cultura em 500 ml tubos de centrífuga Nalgene. Equilibrar a carga e células de colheita por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Determinar o peso úmido de pellet celular. </li><li> Ressuspender as células peletizada na TDT buffer [2 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Transferir a suspensão de célula para 50 ml, tubos de plástico Falcon. </li><li> Girar os tubos a 70 rpm em um agitador por 20 min a 30 ° C. </li><li> Células colheita por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células em tampão Zymolyase peletizadas sem Zymolyase [7 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células em tampão Zymolyase peletizadas sem Zymolyase [7 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Transferência de suspensão de células para um balão de vidro. </li><li> Adicionar o pó de Zymolyase-100T [1 mg de células (peso úmido) Zymolyase-100T / g] para a suspensão de células. </li><li> Gire o frasco com suspensão de células em 70 rpm em um agitador por 30 min a 30 ° C. </li><li> Esferoplastos transferência formado devido à digestão da parede celular com Zymolyase-100T de 50 ml, tubos de centrífuga de plástico. </li><li> Pellet esferoplastos por centrifugação por 8 min a 2200 xg, a 4 ° C. </li></ol> ** Todas as etapas subseqüentes devem ser realizados a 4 ° C ou em gelo. Suspensões de esferoplastos devem ser manuseados com cuidado usando pipetas com pontas cortadas para evitar a quebra organelas .** <ol start="18"><li> Ressuspender esferoplastos peletizada na gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Pellet esferoplastos por centrifugação por 8 min a 2200 xg, a 4 ° C. </li><li> Ressuspender esferoplastos peletizada na gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Transferência de células para um pré-refrigeradas em gelo copo homogeneizador. </li><li> Usando um pilão apertado, homogeneizar as células, fazendo 15 batidas do pilão. </li><li> Adicionar um volume de gelada tampão de homogeneização. </li><li> Transferência esferoplastos homogeneizada a 50 ml tubos de centrífuga de plástico. </li><li> Pellet as células intactas, núcleos e partículas grandes por centrifugação por 5 min a 1500 xg, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o sobrenadante resultante para 5 min a 3000 xg, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o sobrenadante por 15 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender em pellet gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Centrifugar por 5 min a 3000 xg, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o sobrenadante por 15 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender pellet em 3 ml de gelado de buffer SEM. </li></ol> ** Embora esta suspensão é enriquecido na mitocôndria, que também contém outras organelas como o retículo endoplasmático (microssomos), Golgi e vacúolos. Para obter a mitocôndria pura, esta fração de petróleo mitocondrial pode ser submetido a fracionamento ainda, conforme descrito abaixo .** Purificação de mitocôndrias desprovida de contaminação por outras organelas <ol><li> Ml lugar de 1,5 gelada 60% (w / v) de sacarose na EM tampão em um tubo de centrífuga Beckman Ultra-Clear. </li><li> Sobreposição de 60% (w / v) de sacarose, com 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23%, 1,5 ml de sacarose 15% (todos tampão wt / v em EM). </li><li> Coloque 3 ml da fração mitocondrial em bruto SEM tampão em cima de 15% (w / v) de sacarose. </li><li> Centrífuga em uma Ti SW41 rotor Beckman balançando-balde por 1 hora a 134.000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C. </li><li> A mitocôndria forma intacta uma faixa marrom na interface de sacarose 60% / 32%. </li><li> Remova cuidadosamente sacarose até chegar a banda mitocondrial. </li><li> Retire a banda mitocondrial utilizando uma pipeta com uma ponta de corte e colocá-lo em um tubo de centrífuga Beckman para um rotor-5 MLS. </li><li> Encha o tubo com tampão de SEM. </li><li> Pellet as mitocôndrias pura por centrifugação em um rotor MLS-5 para 30 min a 10.000 xg (31.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante usandouma pipeta. </li><li> Use as mitocôndrias pura para a análise de funções mitocondriais, proteoma mitocondrial e lipidome e DNA mitocondrial. </li></ol> Reagentes <ol><li> TDT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitol] (para 15 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1,5 ml de um tampão Tris/H2SO4 M (pH 9,4) </li><li> 150 mL de 1 M DTT </li><li> Volume para 15 ml </li></ul></li><li> Zymolyase tampão [20 mM fosfato de potássio (pH 7,4), 1,2 M sorbitol] (para 100 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2 ml de um tampão fosfato de potássio M (pH 7,4) </li><li> 60 ml de 2 M sorbitol </li><li> Volume de 100 ml </li></ul></li><li> Tampão de homogeneização [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (para 250 ml] <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 M Tris / HCl (pH 7,4) </li><li> 75 ml de 2 M sorbitol </li><li> 500 mL de 500 mM EDTA </li><li> 0,5 g de BSA </li><li> Volume para 250 ml </li></ul></li><li> SEM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM de sacarose, 1 mM EDTA] (para 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 MOPS M / buffer KOH (pH 7,2) </li><li> 31,25 ml de 2 M de sacarose </li><li> 500 mL de 500 mM EDTA </li><li> Volume para 250 ml </li></ul></li><li> EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (para 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 MOPS M / buffer KOH (pH 7,2) </li><li> 500 mL de 500 mM EDTA </li><li> Volume para 250 ml </li></ul></li></ol>

<ol>
	<li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry.">Biochemistry.</a> , (2004).</li><li>Suen, D. -. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics.">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li><li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+more+than+just+a+powerhouse.">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li><li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+oxidants,+and+aging.">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este método permite o isolamento de alto rendimento de mitocôndrias puro de células de levedura. Mitocôndrias purificadas por esse método são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação. O método descrito rendimentos mitocôndrias, que são adequados para células livres reconstituição de processos essenciais mitocondrial. Estas mitocôndrias altamente puro pode também ser usado para a análise da estrutura mitocondrial ...

purification of mitochondria from yeast cells

As mitocôndrias são o principal local de produção de ATP durante o metabolismo aeróbico em eucariotas não fotossintéticos células<sup&gt; 1</sup&gt;. Essas organelas complexo também desempenham um papel essencial na morte celular por apoptose<sup&gt; 2</sup&gt; Sobrevivência da célula,<sup&gt; 3</sup&gt; Desenvolvimento, mamíferos<sup&gt; 4</sup&gt; Desenvolvimento, e função neuronal<sup&gt; 4</sup&gt; Sinalização, intracelular<sup&gt; 5</sup&gt;, Longevidade e regulação<sup&gt; 6</sup&gt;. Nosso entendimento desses processos biológicos complexos controlados pela mitocôndria depende métodos robustos para avaliar sua morfologia, sua proteína e composição lipídica, a integridade de seu DNA, e suas numerosas funções vitais. A levedura de brotamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Uma geneticamente e bioquimicamente eukaryote manipuláveis ​​unicelulares com genoma anotado e bem definidos, proteoma, é um modelo valioso para estudar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes funções biológicas essenciais da mitocôndria. Para estes tipos de estudos, é crucial ter mitocôndrias de alta pureza. Aqui nós apresentamos uma descrição detalhada de um método rápido e eficaz para a purificação de levedura mitocôndrias. Este método permite o isolamento de mitocôndrias altamente puros que são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação. Mitocôndrias purificadas por esse método são adequados para células livres reconstituição de processos essenciais mitocondrial e pode ser usado para a análise da estrutura mitocondrial e funções, proteoma mitocondrial e lipidome e DNA mitocondrial.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Mitochondria from Yeast Cells at JoVE.com

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Nós descrevemos um método rápido e eficaz para a purificação de mitocôndrias da levedura<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Este método permite o isolamento de alto rendimento de mitocôndrias puro que são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação.

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

purification-of-mitochondria-from-yeast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

24.9K visualizações.  Concordia University. Nós descrevemos um método rápido e eficaz para a purificação de mitocôndrias da levedura Saccharomyces cerevisiae. Este método permite o isolamento de alto rendimento de mitocôndrias puro que são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação.