Agradecemos a J. Sedgewick de assistência na criação do microscópio confocal para capturar imagens de grãos de prata; suportados em parte pelo NIH concede pesquisa AI48484 (ATH), AI20048 (RA), e AI066314 (CJM); Centro Nacional de Pesquisa de Recursos subvenção. RR00169 (CNPRC, University of California, Davis).

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li et al. Ciência 323, 1726-1729 (2009)</a> . Combinados em coloração tetrâmero situ e in situ hybridization (ISTH) procedimentos Procedimentos ISTH pode ser dividido em 4 etapas: 1) coloração IST de antígeno específico células T CD8 + nos tecidos; 2) ISH para detectar infectados por vírus de RNA + células, 3) imagens microscópicas confocal do IST-células coradas e viral-RNA + células; 4) análise de imagem, incluindo a construção de montagens de imagens e mapeamento de tetrâmero + + e RNA do vírus das células. 1. IST coloração do antígeno específico células T CD8 + em seções do tecido. <ol><li> Cortar tecidos frescos em 200 um de espessura usando um vibratome ou bisturi. </li><li> Banho frio vibratome com PBS esterilizado e chill-H para 0-2 ° C. Defina o ângulo de lâmina para um vibratome bastante íngreme 27 °. Sempre que possível, manter tecidos refrigerados em gelo, a fim de minimizar a degradação. Tecido fresco é também mais fácil de usar uma seção vibratome quando está frio. </li><li> Cortar o tecido com tesoura ou bisturi cirúrgico em pequenos aproximadamente 0,5 cm de largura por 0,25 cm de altura peças. Coloque pedaços de tecido em um barco pesar ou pequeno prato e cubra com ~ 40 ° C derreteu PBS 4% tamponado baixo derreta agarose. Certifique-se o tecido está em contato com o fundo do prato. Empurrar pedaços de tecido para baixo se eles flutuam. Solidificar em gelo. Isso normalmente leva 3-5 minutos. </li><li> Brasão bloco de tecido com cola Loctite vibratome. Cortar em torno de agarose tecido com um bisturi, e em seguida, usando uma pinça, transferir cuidadosamente o tecido frágil agarose incorporados a um bloco vibratome revestida em cola. Não mova o pedaço de tecido, uma vez que está situado no bloco de tecido. Deixe secar cerca de 10 minutos no gelo. </li><li> Monte bloco de tecido na vibratome e cortar o tecido em 200um de espessura usando uma velocidade lenta mortos para a frente e amplitude relativamente elevada. Configurações de velocidade e amplitude variam com cada vibratome. Se um vibratome não está disponível, ou tecido não é passível de vibratome corte, corte de tecidos em tiras finas utilizando um bisturi. </li><li> Transferência de seções com um pincel em uma câmara de tecido situado no poço de uma placa de cultura de 24 poços de tecido contendo 1 ml de PBS refrigerado-H. Colocar até quatro seções de tecido em cada câmara de tecido. Rótulo a tampa da placa de cultura de tecidos com informações da amostra experimental e tampa segura a placa com um elástico. </li><li> Alternativamente, para tecidos que não cortam bem com vibratome, como intestino, pode cortar tiras finas como possível com lâmina de bisturi ou navalha. Coloque apenas uma seção por bem para cortar seções bisturi. </li><li> Proceder à coloração imediatamente após terminar de tecidos de corte. Manter seções refrigeradas para minimizar a degradação em todos os momentos, até fixo. Não deixe secar seções. Manter seções refrigeradas estéril PBS-H. </li><li> Incubar secções de tecido durante a noite com 0,5 mg / ml FITC tetrâmeros conjugados. Pode incluir ou não do rato-coelho anticorpos dirigidos a epitopos extracelular neste incubação, por exemplo, anticorpos anti-CD8, diluído 1:200 em solução de bloqueio. Use 1 ml de solução por bem para esta e todas as incubações subseqüentes, e realizar esta e todas as incubações subseqüentes a 4 ° C, com placas em uma plataforma de balanço. Mantenha câmaras do tecido contendo diferentes amostras experimentais separados por pelo menos um vazio bem para evitar a contaminação cruzada de soluções em etapas subseqüentes. </li><li> Após a incubação primária, lavagem de seções com refrigerados PBS-H duas vezes (2X) por 20 minutos cada. Fazer isso, transferindo as câmaras de tecido para uma placa de cultura diferente de 24 poços contendo tecidos refrigerados PBS-H. Tenha cuidado para não escorrer o conteúdo de uma amostra experimental em outro, quando se deslocam câmaras do tecido. Para todas as incubações subseqüentes e lavagens de forma semelhante a transferência das câmaras de tecido para um prato limpo contendo a solução adequada. Monitorar seções em câmaras de tecido durante o procedimento para se certificar de que as seções não ficar preso para os lados das câmaras de tecido. </li><li> Seções fixar com PBS fresco buffered paraformaldeído 4% por 2 horas em temperatura ambiente. Lavar com água fria PBS-H 2X 5 min cada. </li><li> Incube com coelho anti-FITC anticorpos, por exemplo, Biodesign1: 10.000, em solução de bloqueio de 1-3 dias. Para co-rotulagem, pode incluir não-coelho anticorpos dirigidos a epitopos intracelular neste incubação também. Para esta opção, se necessário expor os epítopos e permeiam e bloquear as células antes da segunda incubação. </li><li> Se os anticorpos dirigidos a epitopos usando intracelular que requerem recuperação antigênica de fixação em formol, expor epítopos fervendo 3 vezes em 0,01 M de uréia, 10 segundos de cada vez, em um forno de microondas. Aguarde 2 minutos entre cada aquecimento. Tenha muito cuidado como solução a ferver pode forçar as seções dos poços. Se isso acontecer, use um pincelpara empurrar seções das laterais da câmara de tecido ou da tampa da placa de volta para o fundo da câmara de tecido apropriado. Se os anticorpos não requerem recuperação antigênica omitir este passo. </li><li> Se estiver usando anticorpos dirigidos a epitopos intracelular, antes da segunda incubação, permeabolize e bloquear as células em secções de tecido com PBS-H com 0,3% de triton X-100, e 2% de soro normal de cabra por uma hora. Em seguida, realizar incubações de anticorpos restantes em PBS-H com 0,3% de triton X-100 e soro de cabra 2% normal. </li><li> Após a incubação segundo, lave seções em PBS-H por 20 minutos a várias horas. Repita duas vezes para um total de três lavagens. Realizar uma incubação final com as devidas anticorpos fluorescente etiquetado. Por exemplo, cabra anti-coelho Cy3 e de cabra anti-mouse-Alexa 488 diluído 1:1000 cada em solução de bloqueio. Incubar por 1-3 dias. Mantenha seções protegidas da luz por envolvimento das placas em folha de alumínio durante a incubação e, posteriormente, como fluoróforos luz apaga. </li><li> Lave os cortes em PBS-H por 20 minutos a várias horas. Repita duas vezes para um total de três lavagens. </li><li> Para IST combinado com ISH pós-fix seções pós-fix em paraformaldeído 4% por 1 hora para tetrâmeros seguro e anticorpos no local, em seguida, lavar seções com PBS-H de novo e de montagem. </li><li> Use um pincel para transferência de seções para uma lâmina de microscópio. Seção de revestimento, cada um com glicerol / gelatina contendo 4mg/ml gallate n-propil ou outros meios de montagem contendo um conservante fluoróforo e cobrir com uma lamela. Slides armazenar em recipiente de lâminas de luz protegida em -20 °. Enxágüe placas de cultura de tecidos e remover rótulos de tampas com álcool. Pode reutilizar placas. </li><li> Analisar cortes de tecidos corados com um microscópio confocal. Em seguida, pode proceder à ISH. </li></ol> 2. Detectar infectados por vírus de RNA + células por hibridização in situ. Isso no protocolo de hibridização in situ foi modificado de nossos protocolos publicados anteriormente 4,5 da seguinte forma: <ol><li> Re-cut 5-8 micra de espessura-sectionss de espessura em cortes corados situ tetrâmero. <ol><li> 200 mícrons de espessura-seções são aquecidas a 70 ° C por 5 min para separar a seção do slide. </li><li> A seção é então incorporado em outubro em gelo seco. </li><li> 8-micron seções são cortadas com um criostato das seções de espessura e adere a lâminas silanizadas. </li><li> Lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C em uma caixa selada para posterior hibridização in situ. </li></ol></li><li> Hibridização in situ <ol><li> Reidratar cortes de tecido por imersão slides por 3 minutos cada em etanol 90% e DEPC água tratada. </li><li> Permeabilizar cortes de tecido por aquecimento em tampão citrato 10mM (pH 6,0) a 98 ° C em banho-maria por 15 min. </li><li> Secções de tecido fresco à temperatura ambiente por 20-30 min. </li><li> Lavar duas vezes em água tratada DEPC-por 3 min. </li><li> Acetilam secção de tecido por imersão slides em 0,25% de anidrido acético em 0,1 M TEA (trietanolamina, pH8.0) por 10 min. </li><li> Transferência de slides em 0,1 M TEA (pH8.0) por 5 min. </li><li> Hibridizar seções a 35 S-rotulados de vírus específicos (como o HIV-1, SIV) sonda antisense ou senso (controle negativo para o HIV-1, SIV), ou 35 S-rotulados riboprobes LCMV (sentido reunidos e antisense). </li><li> Lave duas vezes com seções 2xSSC por 5 min após a hibridização durante a noite a 42 ° C. </li><li> Lave os cortes em STE (0,5 M de NaCl, 1mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) por 5 min. </li><li> Digest seções com RNases A e T1 na STE a 37 ° C por 30 min </li><li> Lave os cortes em 2x SSC mais formamida 50% por 5 min. </li><li> Lave os cortes em 1x SSC 10 min. </li><li> Lave os cortes em 0,5 x SSC 15 min. </li><li> Desidratar seções 70, 80 e 100% de etanol contendo 0,3 M de acetato de amónio, cada 5 min. </li><li> Seções revestimento com emulsão nuclear faixa </li><li> Seca em um quarto escuro por 1 hora. </li><li> Expor seções a 4 ° C para 11 dias (SIV) e 3 dias (LCMV). </li><li> Desenvolver seções em D19 (Kodak, Cat # 146 4593) por 3 min, lavagem em dH2O 30 segundos, corrigir em Rapid Fixer (Kodak, Cat # 146 4106) por 4 min, lavar em dH2O 5 min x 3 vezes. </li><li> Desidratar em 70%, 80% e etanol absoluto, 5 min cada. </li><li> Slides de montagem no fluorescentes médio Permount compatíveis. </li></ol></li></ol> 3. Aquisição de imagens de microscopia confocal. <ol><li> Capturar imagens com uma ISTH Bio-Rad MRC 1000 Microscópio Confocal, ou qualquer outro microscópio confocal com Epi2-Blue dispositivo de reflexão. </li><li> Use Epi1-605 para o tetrâmero vermelho fluorocromo, Epi2 DF32-522 para o verde CD8 fluorocromo, ea reflexão Epi2-Blue para grãos de prata (sinal ISH na radioautographs desenvolvidos) a 20x (para SIV) ou 60x (para LCMV) </li><li> Seqüencialmente coletar Z-serial imagens em um micro-intervalos nos três canais de cada campo. </li><li> Adquirir imagens de cada seção da esquerda para aimagem da direita e de cima para baixo, o nome ea cada um segundo a sua linha e coluna em um arquivo Excel. </li><li> Captura de cada imagem com uma sobreposição de ~ 20% com suas imagens vizinhos para evitar falhas na imagem reconstruída montagem. </li></ol> 4. Análise de imagem: a reconstrução da imagem montagem, cálculo de célula centróide e análise espacial. <ol><li> Projeto Z-série de imagens em uma única imagem para cada canal com o Assistente de Confocal (Versão 4.02).. </li><li> Mesclar automaticamente a imagem projetada de três canais em uma imagem RGB, usando um procedimento de Ação Photoshop 7.0. </li><li> Gerar uma imagem de montagem por costura imagens unidas em camadas no Photoshop 7.0. </li><li> Associar grãos de prata individual e tetrâmero mancha com células, e atribuir a X, Y coordenadas dos centros (centróides) da RNA SIV + + e células tetrâmero, usando Metamorph (versão 7.1.3.) Ou Photoshop (disponível a partir do autor) </li><li> Exportar dados em arquivos Excel centróide como números numéricos para cada célula. E: T índices são determinados a partir dos arquivos do Excel a partir do número total de tetrâmero + + e RNA viral células na seção. </li></ol> Relações espaciais entre vermelha tetrâmero e SIV + azul + RNA células são capturados, copiando e colando suas respectivas parcelas a partir dos arquivos do Excel em um documento do Photoshop. Depois de diminuir a opacidade de uma camada para alinhar e escala as grades para que elas coincidam, cor-selecionar e copiar e colar em uma nova camada a posição dos azuis RNA + células, e em seguida descartar a camada usada para alinhar as grades, as posições do tetrâmero + + e RNA viral células será revelado na imagem achatada. 5. Notas adicionais Se o corte do tecido infecciosas: Trabalhar em um laboratório BSL2.5. Tome precauções especiais com lâminas de barbear. Coloque a navalha na lâmina vibratome montar com uma pinça. Se você não pode colocar a lâmina com uma pinça, coloque-o no tecido antes de adicionar ao banho, e não substituir a lâmina. Ao cortar terminar, retire a lâmina com uma pinça. Spray de lâmina com EtOH 70% ou DMQ antes da remoção. Como sempre, dispor de lâminas em um recipiente. Mudar de luvas exterior ou enxágüe em desinfetante após cada contato com o tecido ou PBS contaminado no tanque. Quando terminar, se trabalhar com material infeccioso, adicione desinfetante DMQ a PBS no tanque e deixe descansar alguns minutos antes de remover. Dispor de PBS descontaminados pelo ralo. Em seguida, lavar o tanque com água para remover o sal e desinfetante. Local de trabalho limpo e utensílios com DMQ. Lave utensílios com água. Fazer tetrâmeros da monômeros biotinilado MHC: Obtenção de MHC classe I biotinilado moléculas como HLA-A * 0201 / B 2 m / moléculas de peptídeo produzido com qualquer mordaça (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV), ou irrelevantes MART peptídeo (ELAGIGILTV) peptídeos da Beckman Coulter. Biotinilado HLA-A * 0301 / B 2 m / moléculas de peptídeo produzido com qualquer mordaça (KIRLRPGGK) ou Nef (QVPLRPMTYK) na instalação tetrâmero NIAID. Tetrâmeros são gerados pela adição de seis alíquotas de FITC ExtraAvidin (Sigma) para biotinilado Mamu A. * 01 / B 2 m / peptídeo monômeros ao longo de 8 horas para um rácio final molar de 4,5:1 A lógica por trás de adicionar o Extravidin lentamente é que durante os pontos de tempo no início há uma superabundância de monômero que assegura que todos os Extravidin acrescentou recebe todos os quatro sites de biotina ligado. Mais tarde, na reação, este processo é menos eficiente porque há menos monômero de esquerda e mais uma chance de que ExtrAvidin não terá todos os 4 sites vinculados. Se adicionados todos os ExtrAvidin menos uma vez a reação seria menos eficiente e mais moléculas Extravidin teria apenas 2 ou 3 monômeros em anexo.

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	<li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li><li>Qingsheng, L. i., Skinner, P. J., Ha, S. -. J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li><li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue.">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li><li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells.">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li><li>Li, Q. i. n. g. s. h. e. n. g., Estes, J. a. c. o. b. D., Schlievert, P. a. t. r. i. c. k. M., Duan, L. i. j. i. e., Brosnahan, A. m. a. n. d. a. J., Southern, P. e. t. e. r. J., Reilly, C. a. v. a. n. S., Peterson, M. a. r. n. i. e. L., Schultz-Darken, N. a. n. c. y., Brunner, K. e. v. i. n. G., Nephew, K. a. r. l. a. R., Pambuccian, S. t. e. f. a. n., Lifson, J. e. f. f. r. e. y. D., &amp;amp, J. o. h. n. V. C. a. r. l. i. s., Haase, A. s. h. l. e. y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission.">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Já que o vírus RNA é usado como um marcador para as células infectadas por vírus neste relatório, todos os reagentes antes de hibridação deve ser RNAase livre. O procedimento de hibridização in situ aqui descrito foi modificado para preservar o sinal fluorescente na coloração de tetrâmero situ. Como o sinal radioautographic de infectados por vírus de células detectadas por hibridização in situ é a uma profundidade de cerca de um celular de diâmetro, as seções de espessura utilizada na coloração tetrâmero situ têm de ser recut em 5-8 mícrons de espessura. Esta nova técnica de combinar em tetrâmeros situ e hibridização in situ (ISTH) aqui descrito permite a visualização simultânea, mapeamento e análise da relação espacial de vírus específicos células T CD8 + e-vírus infectou as células-alvo. Este método pode ser aplicado para avaliar CD8 + vacina de células T com base e em patógeno-vírus não outros e interações hospedeiro. O método de análise de imagem descrito aqui também pode ser usado para estudar as relações espaciais de qualquer populações de duas células interagindo in situ, por exemplo, que recentemente usou o procedimento de mapeamento centróide no estudo do HIV-1 de transmissão sexual no modelo de primata não humano de imunodeficiência símia infecção por vírus de macacos rhesus 6

Soluções e Reagentes: <ul><li> PBS-H tampão de fosfato heparina contendo salina (100ug/ml ou 18.7U/ml) para inibir RNases </li><li> Meios de cultura contendo tecido RPMI heparina (100ug/ml ou 18.7U/ml) para inibir RNases </li><li> 4% baixo derreta agarose em PBS </li><li> PBS com soro de cabra 2% normal (ou soro de espécies em que os anticorpos conjugados fluoróforo foram feitas). </li><li> PBS com soro de cabra 2% normal e 0,3% triton X-100 </li><li> MHC classe I tetrâmeros conjugado com FITC </li><li> Anti-FITC anticorpos, por exemplo, Biodesign de coelho anti-FITC </li><li> Fluoróforo conjugado anti-IgG de coelho que tem sido altamente adsorvido cruz para outras espécies IgG para utilização com múltiplos rotulagem, por exemplo, de cabra anti-coelho-Cy3 </li><li> Fluoróforo conjugado anti-IgG de rato que tem sido altamente adsorvido cruz para outras espécies IgG para utilização com múltiplos rotulagem </li><li> PBS fresco buffered paraformaldeído a 4% </li><li> 0,01 M de uréia </li><li> Glicerol / gelatina contendo 4mg/ml gallate n-propil </li></ul> Equipamentos especiais <ul><li> Vibratome </li><li> Bisturi </li><li> Giletes </li><li> Tesoura cirúrgica </li><li> Adesivo Instantâneo Loctite Quick Set (produto # 46551) </li><li> Fórceps </li><li> # 2 escovas de camelo pintar cabelo. Pode cortar com lâmina de barbear para espessura desejada </li><li> 24 poços de fundo plano placas de cultura de tecidos, por exemplo catálogo Falcon # 353226 </li><li> Compartimentos do tecido </li><li> Folha delgada de estanho </li><li> Papelão deslize pasta catálogo, por exemplo Fisher # 12-587-10 </li><li> Microscópio confocal </li></ul> Reagentes IST de Referência Rápida PBS-H (tampão fosfato salina com heparina) <ul><li> 450 ml de 1X PBS </li><li> 50 ml de 1X PBS + heparina 10X </li></ul> 1x PBS + heparina 10X <ul><li> 500 ml de 1X PBS </li><li> 500 mg de heparina em pó (encontrado na prateleira de armazenamento químico seco) </li></ul> NGS PBS-H / 2% (soro normal de cabra) <ul><li> 49 ml PBS-H em tubo de Falcon </li><li> 1 NGS ml (encontrada em 1 ml alíquotas em -20 freezer) </li></ul> NGS PBS-H / 2% / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 49 ml PBS-H / Triton 0,3% X-100 em tubo de Falcon </li><li> 1 NGS ml (encontrada em 1 ml alíquotas em -20 freezer) </li></ul> PBS-H / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 500 ml PBS-H </li><li> 1,5 ml Triton X-100 (este é um líquido espesso encontrado em prateleiras de armazenamento químico seco) </li></ul> 4% LMP Agarose <ul><li> 2 g de agarose LMP em pó </li><li> 50 ml PBS </li><li> Agite até microondas, misturado até o pó se dissolve. </li></ul> GG-NPG (glicerol gelatina com n-propil galate <ul><li> Coloque uma garrafa de glicerol gelatina em banho-maria 50 graus para derreter </li><li> Adicionar 0,06 g de propil galate (encontrado na prateleira Terris), agitar bem </li><li> Mantenha em banho-maria, agitando ocasionalmente até dissolver. </li><li> Alíquota em 1 ml tubos (tubos marrom) </li></ul> Paraformaldeído a 4% <ul><li> 4 paraformaldeído em pó g (encontrado em prateleiras de armazenamento químico seco) </li><li> Coloque cerca de 10 ml PBS-H em um cilindro graduado, adicionar o pó pf </li><li> Adicione um pouco de água até o volume atinge cerca de 70 ml </li><li> Adicionar um conta-gotas de NaOH. </li><li> Mexa até dissolver (geralmente cerca de 20-30 minutos) </li><li> Adicionar HCl até pH atinge entre 7-8. </li><li> Trazer um volume de 100 ml com água. </li></ul> Ureia 0,01 M <ul><li> 0,3 g de uréia (encontrado em prateleiras de armazenamento químico seco) </li><li> 500 ml de água </li></ul>

a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ

Os números e os locais de vírus específicos células T CD8 + em relação ao número e da localização de seus alvos célula infectada é pensado para ser crítico na determinação dos resultados que vão desde a autorização para infecções crônicas persistentes. Descrevemos aqui um método para avaliar as relações espaciais e quantitativas entre imunes efetoras (E)-vírus específicos células T CD8 + e metas infectados (T) que combina in situ tetrâmero coloração (IST) para detectar o vírus específicos células T CD8 + e in situ hibridação (ISH) para detectar-RNA viral + células nos tecidos, onde a batalha entre as defesas imunes e infecção ocorre. A combinação de coloração IST e ISH, abreviado ISTH, permite a visualização e mapeamento da localização das células efetoras imunes e metas, e determinação fácil de E: relações T. Esses parâmetros, por sua vez pode então ser usada para determinar as relações entre proximidade espacial, eo tempo e magnitude da resposta imune que predizem resultados em infecção precoce.

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A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Uma técnica que combina na coloração tetrâmero situ e hibridização in situ (ISTH) permite o mapeamento, visualização e análise da proximidade espacial de vírus específicos células CD8 + T ao seu infectados por vírus metas e determinação das relações quantitativas entre estes efetores imunes e metas aos resultados infecção.

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

a-technique-to-simultaneously-visualize-virus-specific-cd8-t-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

12.0K visualizações.  University of Minnesota. Uma técnica que combina na coloração tetrâmero situ e hibridização in situ (ISTH) permite o mapeamento, visualização e análise da proximidade espacial de vírus específicos células CD8 + T ao seu infectados por vírus metas e determinação das relações quantitativas entre estes efetores imunes e metas aos resultados infecção.

Vídeo: A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

Células T reguladoras: potencial terapêutico para tratar a rejeição de transplantes e Diabetes Tipo I

Biologia

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing das células hematopoiéticas da medula óssea

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogênica Ensaio: células aderentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ

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