Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Knowledge Development Fund, British Columbia Genoma ea British Columbia Ministério de Florestas e Faixa para apoiar estudos em andamento de produtividade do solo da floresta. SL foi apoiado por uma bolsa da Fundação Centro TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.

Parte I: Extração de DNA Procedimento 1. 8 horas são necessárias, para o processamento de 6 amostras excluindo quantificação de DNA. Antes de iniciar a extração, você vai precisar de pré-chill morteiro pilão, e espátula em um freezer -20 ° C ou usando nitrogênio líquido. Além disso, pré-chill tubos de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio álcool isoamílico (24:1) no gelo. Definir o forno de hibridação a 65 ° C para pré-aquecer. Verifique solução CTAB, se é cristalizado quente a 60 ° C para derreter os cristais. Completar a solução de desnaturação e tampão de extração, adicionando os ingredientes passada, pouco antes de começar a extração (veja a receita abaixo). Realizar todos os procedimentos de extração em uma capela. 2. Preparar o tampão de desnaturação e tampão de extração. Nota: Para maximizar o rendimento de DNA, é fundamental para fazer precisamente buffers seguir as instruções. 3. Colocar 2 g de solo em uma argamassa pré-refrigeradas. Nota: O solo coletados em campo devem ser congeladas em gelo seco para o transporte e armazenadas a -80 ° C. Descongelar e solo peneira com uma peneira de 2 mm antes da extração do DNA. Você pode aumentar o montante inicial do solo até 10 g. 4. Adicionar 1 ml de solução de desnaturação ao solo. 5. Congelamento e moer o solo em N 2 líquido usando um pilão até que as partículas do solo olhar em pó e homogênea. Repita congelamento e trituração duas vezes. Nota: Mantenha a amostra de solo congelado durante a moagem, utilizando nitrogênio líquido suficiente para cobrir totalmente a amostra de solo. Derretendo ligeira durante a moagem é aceitável. 6. Transferir o solo de terra para um tubo de 50 ml com uma espátula de pré-refrigerados. Nota: A amostra de solo solo podem ser armazenadas a -80 ° C neste momento, se necessário. 7. Adicionar 9 ml de tampão de extração. Para misturar a solução e no solo, brevemente vortex em baixa velocidade. Nota: Para garantir o buffer é homogênea, aquecê-lo a 60 ° C por 10-15 minutos antes de usar. Manter o resto de tampão a 60 ° C em toda a extração. Vortex em velocidade 8 (numa escala onde 10 é o máximo). 8. Incubar por 40 min a 65 ° C em um forno de hibridização. Durante a incubação, os tubos de girar continuamente na velocidade mais baixa, ou inverter cuidadosamente os tubos a cada 10 minutos. Nota: Coloque o tubo horizontalmente em um forno de hibridização para permitir buffer de entrar em contato com o solo sobre uma grande superfície. A solução pode parecer um pouco viscoso durante a incubação. 9. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C. Transfira o sobrenadante para a pré-refrigerados tubo de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), manter no gelo. Nota: Quando você transferir o sobrenadante, tome cuidado para não perturbar a camada orgânica (camada inferior). Deixe 1-2 ml de sobrenadante, se for necessário, a fim de coletar somente o sobrenadante limpo. Muitas vezes você pode ver uma camada de bege (mm aproximadamente 1-3 de espessura) em cima do sobrenadante. Não perturbe essa camada ao coletar o sobrenadante. Tente deslizar a ponta ao longo da parede do tubo para impedir a ruptura desta camada bege. Se o sobrenadante é muito turvo, repetir a extração de álcool clorofórmio-isoamílico mais uma vez no sobrenadante. Não use pipetas plásticas descartáveis ​​ao transferir clorofórmio, como clorofórmio irá derreter o plástico. Use uma pipeta de vidro, ou um copo cilindro graduado, ou derramar clorofórmio diretamente em tubos cônicos de 50 ml. 10. Extraia o pelotas do solo mais 2 vezes; 10.1. Adicionar 5 ml tampão de extração para as pelotas do solo, misture delicadamente com 1 ml ponta seguido por vórtex breve em baixa velocidade. Nota: Agite e misture o buffer antes de usar. 10.2. Incubar a 65 ° C por 10 min em forno de hibridização. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C. Transfira o sobrenadante para o tubo no passo 9. Manter o tubo com sobrenadante coletado e clorofórmio-álcool isoamílico em gelo durante a extração. Nota: Certifique-se de adicionar o sobrenadante para o tubo mesmo sem cruzar a mistura entre as amostras. 10.3. Repita 9.1 e 9.2 mais uma vez. 11. Usando uma placa rotativa, muito suavemente balance o tubo que contém o sobrenadante (14-19 ml) e clorofórmio-álcool isoamílico em 1,25 rpm por 10 min. Nota: Feche a tampa com muito rigor para evitar fugas. Coloque uma toalha de papel sobre a placa de balanço antes de colocar o tubo de modo que qualquer vazamento pode ser facilmente detectado. 12. Centrifugar a 1800 x g, por 20 min a 10-14 ° C. 13. Transferência de fase aquosa para um novo tubo. Nota: Não perturbar a interfase entre a fase aquosa (camada superior) e camada orgânica (inferiorcamada) quando você transferir o sobrenadante. Deixe aproximadamente 1,5-2 ml sobrenadante para garantir a coleta de apenas sobrenadante limpo. 14. Recuperar o DNA usando álcool isopropílico (15.a etapa - 21.a). Alternativamente, use Amicon ® Ultra-15 Centrífuga Dispositivos Filter (passo 15.b - 21.b) se você esperar muito baixa quantidade de biomassa em sua amostra, que irá produzir pellet dificilmente visível por isopropílico precipitação de álcool que é difícil de recuperar. 15.a. Coloque o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga novo. 16.a. Adicionar álcool isopropílico para o sobrenadante coletado em uma relação de volume de 0.6:1. Inverter os tubos suavemente algumas vezes para misturar. 17.a Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. 18.a. Centrifugar a 16.000 x g, por 20 min a 20-25 ° C. Garantir os pesos de todos os tubos são equilibradas bem antes da etapa de centrifugação. Nota: Mark a direção da força centrífuga sobre o tubo, para que você possa detectar o pellet de DNA com mais facilidade quando o rendimento de DNA é baixa. 19.a. Remover álcool isopropílico por decantação ou aspiração a vácuo. Tenha cuidado para não perturbar o pellet de DNA. Nota: Remover álcool isopropílico, logo que a centrifugação seja concluída. Tenha muito cuidado para não perder o pellet de DNA. O tamanho do pellet de DNA pode variar muito, dependendo do tipo de solo, a partir de uma bem visível (~ 9 mm de diâmetro) para apenas visível. É recomendado para remover os resíduos de álcool isopropílico por aspiração ao longo da parede do tubo com cuidado para não sugar o pellet de DNA. 20.a. Seca DNA pellet em temperatura ambiente por 5-20 min. Nota: Não mais seco pellet de DNA, caso contrário, será difícil para dissolver o DNA. 21.A. Ressuspender o sedimento de DNA em 200 mL de TE. Misturá-lo tocando suave. Transferir a solução de DNA em tubo de 1,5 ml. Manter o tubo a 4 ° C durante a noite, a fim de dissolver completamente DNA. Nota: Dependendo do tamanho do pellet, você pode ajustar o volume de TE para adicionar. Geralmente 200-400 mL de TE funciona bem. * Como alternativa, siga os passos 15.b - 21.b. 15.b. Uma pré-lavagem Amicon ® Ultra-15 Centrífuga dispositivos de filtro, adicione 15 ml TE para o dispositivo e centrifugar a 3500 x g, por 10 min. Descartar o escoamento. 16.b. Coloque a solução de DNA a partir do passo 13 para o filtro Amicon pré-lavados. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a 200-500 mL. Descartar o escoamento. 17.b. Lavar o DNA com TE duas vezes; adicionar 10 ml TE aos dispositivos Amicon filtro. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a cerca de 200 mL. Descartar o escoamento. Repita mais uma vez. 18-B Transferir a solução de DNA no filtro para um tubo ml novo 1.5. 19.b. Adicionar 40 mL de TE o filtro Amicon. Lavar ambos os lados da membrana do filtro por pipetagem cima e para baixo a fim de recuperar qualquer resíduo de DNA no filtro. Adicionar esta solução de lavagem para o tubo de 18-B passo 20.b. Se necessário, o DNA pode ser ainda mais concentrada por microcontrolador Ultracel YM-30 ® Unidade Centrífuga Filter; pré-lavagem do filtro, adicionando 200 mL de TE e centrifugação a 10.000 x g por 7 minutos. Adicionar a solução de DNA para o filtro e centrifugar a 5000 x g por 1 min. Repetir a centrifugação até que a quantidade de solução de DNA no filtro reduzido a cerca de 50 ul. Nota: Máximo volume da amostra inicial para microcontrolador filtro é de 500 mL. Não centrifugue a velocidades superiores a 14.000 x g. Não mais de centrífuga até a membrana seca completamente. Garantir que algum líquido ainda cobre o filtro após a centrifugação. Se mais de centrifugado e da membrana está seca, em seguida, adicione 15 mL TE, agitar suavemente durante 30 segundos e avance para o passo 21.b. 21.b. Coloque a unidade de filtro de cabeça para baixo em um tubo novo microcontrolador e centrifugar a 1000 xg por 3 min para recuperar o DNA. 22. Quantificar DNA por TAE gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V por 4 horas), e por espectrofotômetro Nanodrop ou Pico-verde ensaio e leitor de placas. Nota: quantidade de DNA pode ser estimado através da comparação da faixa de amostra para a banda marcador com concentração conhecida (marcador molecular de DNA de alta ou λHindIII) sobre o gel. 23. Verificar a integridade do DNA de alto peso molecular por eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE) com 1%, 1xTAE gel (Para mais detalhes veja o Passo II, part2 em <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 por Taupp et al 2009).. Nota: Você pode usar gel agarose regulares para essa finalidade QC, em vez de baixa temperatura de fusão agarose. Em resumo, as condições de eletroforese são as seguintes: 02/0250 kb, 6 volts, tempo de comutação inicial: 5 segundos, tempo final de comutação: 15 seg, executado por 12 horas a 14 ° C. Ouro SYBR coloração de uma hora para visualizar o DNA do gel. 24. Se os pesos moleculares de DNA extraídos são satisfatórios, em seguida, avance para a etapa de centrifugação de gradiente de CsCl seguinte. Alternativamente, o DNA pode ser armazenado a -20 ° C ou -80 ° C antes da centrifugação CsCl. A mediana do tamanho do DNA deve ser igual ou superior a 36 Kb, se você quiser construir uma grande biblioteca de inserir DNA metagenomic. Parte II. Purificação de DNA usando cloreto de césio ultracentrifugação de gradiente Preparação de centrifugação: 1,5 - 2 horas Etapa de centrifugação: 18 horas Removendo brometo de etídio (EtBr) e concentrando o ADN após a centrifugação: 3 horas Procedimento Para detalhes, consulte Wright et al. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 Resultados representante / Resultado A quantidade total de DNA genômico isolado de 2 g de floresta orgânica do solo (horizonte O) e horizontes minerais (Ae, AB, Bt e horizontes) (amostragem da produtividade do solo de Longo Prazo (LTSP) site localizado na Skulow lago, BC, Canadá e gerido pela BC Ministério de Florestas e Range) variou de 10 mg a 180 mg. O tamanho médio de DNA isolado foi geralmente entre 40-60 kb (Figura 1). A relação de absorvância a 260 nm foi nm/280 entre 1,3-1,6 e houve um pico em 230 nm, o que pode indicar a contaminação ácidos húmicos freqüentemente observada em amostras de solo. A centrifugação em gradiente de CsCl reduziu drasticamente essa contaminação e também aumentou a proporção de 260/280 para 1,8-1,9, como mostrado na Figura 2a e 2b. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Imagens figura 1. PFGE do DNA genômico extraído antes ultracentrifugação CsCl. lane1: 1 kb marcador 100 ng, pista 2: λHind III marcador 100 ng, pista 3: λHind III marcador 250 ng, pista 4: λHind III marcador 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marcador 100 ng, pista 6 e 7: genômica DNA isolado do solo de horizonte mineral Ae, pista 8 e 9: o DNA genômico isolado do horizonte AB mineral do solo no local LTSP localizado Skulow lago, BC <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2. Chromograms do DNA genômico detectada pelo espectrofotômetro antes (A) e depois de CsCl ultracentrifugação (B). Observe a redução do valor de absorbância no comprimento de onda nm após 230 CsCl ultracentrifugação, o que indica melhoria na qualidade do DNA genômico. Por favor, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2.

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Receita * Desnaturação solução 4 M isotiocianato de guanidina 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-mercaptoetanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Solução de desnaturação: 10 ml no total </td></tr><tr><td> Isotiocianato de guanidina (MW 118,16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> EDTA 0.5M </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar água a 9,95 ml no total. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar 50 ul 2-mercaptoetanol imediatamente antes da utilização. (5 mL de 2-mercaptoetanol por 1 ml da solução de desnaturação) Nota: Manter a solução de desnaturação a 4 ° C. Não use tampão mais de uma semana. Se possível, faça uma solução tampão nova de usar. </td></tr></table> ** Tampão de extração 100 mM tampão fosfato de sódio [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM EDTA [pH 8,0] 1,5 M NaCl Brometo de hexadeciltrimetilamônio 1% (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Tampão de extração de 1 L, no total </td></tr><tr><td> Sódio 1M tampão fosfato [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave e mantê-lo à temperatura ambiente. </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar 200ml, brometo de hexadeciltrimetilamônio 5% (CTAB, autoclavado) e 100 ml, 20% SDS (autoclavada) imediatamente antes da utilização. Se CTAB foi cristalizado, derretê-lo a 60 ° C. * Tampão fosfato de sódio 1M: 57,7 ml, sódio 1M fosfato monossódico (NaH 2 PO 4) e 42,3 ml, 1M Fosfato de sódio dibásico (NaH 2 PO 4). Ajustar o pH para 7,0 Nota: Não use SDS 20% se tiver precipitação. É normal ver suspensão leitosa quando você adiciona SDS para a solução. Uma vez que você adicionar SDS, coloque o tampão de extração a 60 ° C para garantir SDS é bem suspenso. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

O microbioma do solo é um reservatório vasto e relativamente inexplorado da diversidade genômica e inovação metabólica que está intimamente associado com nutrientes e fluxo de energia nos ecossistemas terrestres. Cultivo independente de genômica ambiental, também conhecida como metagenomic, abordagens prometem um acesso sem precedentes a essa informação genética no que diz respeito à reconstrução caminho e triagem funcional para terapêuticas de alto valor e os processos de conversão de biomassa. No entanto, o microbioma solo ainda permanece um desafio em grande parte devido à dificuldade na obtenção de DNA de alto peso molecular de qualidade suficiente para a produção de grandes inserir biblioteca. Aqui nós apresentamos um protocolo para a extração de alto peso molecular, o DNA genômico microbiana comunidade de solos e sedimentos. A qualidade do DNA genômico isolado é ideal para a construção de grandes bibliotecas genômicas inserir ambientais para aplicações a jusante seqüenciamento e análise. O procedimento começa com a lise celular. Paredes celulares e membranas de micróbios são lisadas por ambas as forças mecânicas (trituração) e químicas (β-mercaptoetanol). DNA genômico é então isolado usando tampão de extração, clorofórmio-álcool isoamílico e álcool isopropílico. Os buffers empregados para a lise e os passos de extração incluem isotiocianato de guanidina e brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) para preservar a integridade do DNA genômico de alto peso molecular. Dependendo da sua aplicação a jusante, o DNA genômico isolado pode ser purificado usando cloreto de césio (CsCl) ultracentrifugação de gradiente, o que reduz as impurezas, incluindo os ácidos húmicos. O primeiro procedimento, a extração, leva aproximadamente 8 horas, com exclusão de etapa de quantificação de DNA. A ultracentrifugação gradiente de CsCl, é um processo de dois dias. Durante todo o procedimento, o DNA genômico deve ser tratada com cuidado para evitar corte, evitar vórtex grave e dura pipetagem repetitiva.

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.5K visualizações.  University of British Columbia - UBC. Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.

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Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Biologia

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

DNA Extraction from 0.22 &amp;mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genômica MRI - um recurso público para estudar os padrões de seqüência dentro de DNA genômico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Extração de DNA de alto peso molecular de Esteiras Microbianas

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Um método prático e inovador para extrair DNA genômico de Kits de coleta de sangue para Preservação Plasma Protein

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucina Agarose Gel Eletroforese: Western Blotting para glicoproteínas alta peso molecular


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

Métodos modificados para carregamento de placas de extração de DNA de alto rendimento reduzem o potencial de contaminação

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...