Agradecemos o apoio do NIH (NS047073 para HJC). Nós também somos gratos a Catherine Kehl para ela primeiras experiências com o Kwik-Sil, que nos incentivou a usá-lo para a nossa aplicação.

1. Fabricação de eletrodos <ol><li> Para criar o eletrodo, use a tesoura para cortar um pedaço do esmalte revestido polegadas de diâmetro do fio de aço inoxidável 0,001 a cerca de 2 metros de comprimento. Anexar uma pequena bola de massa em cada extremidade do fio, dobre o fio ao meio, e gire as pontas para criar um par trançado, chamado eletrodo diferencial. </li><li> Fita ambas as extremidades do fio para evitar o desfiamento. Fazer quatro eletrodos diferenciais, usando uma cor diferente da fita para cada eletrodo diferencial para fins de identificação (Figura 1A). </li><li> Torção dois dos eletrodos diferenciais juntos, deixando duas polegadas sem torção em uma extremidade e uma polegada na outra extremidade. Repita com o restante par de eletrodos diferenciais (Figura 1B). </li><li> Torça os dois conjuntos de dois eletrodos diferenciais juntos, certificando-se que as extremidades permanecem sem torção. Segurar o conjunto de eletrodos e aplicar cola de silicone casa na junção de quatro eletrodos diferenciais, deixando as extremidades livres. Pendurar e permitir que a cola secar por pelo menos 4 horas (Figura 1C). </li><li> Para isolar os ramos, coloque o conjunto de eletrodos para baixo em uma superfície plana, como móveis um pedaço de madeira. Espalham as pontas e prenda-os com fita adesiva. Use um pequeno pedaço de plástico para elevar o conjunto de eletrodos pouco antes de ramos, e seguro que, com fita. </li><li> Em um microscópio de dissecação, utilize uma pinça para revestir os ramos com cola silicone. Os fins de 1 polegada tempo vai estar dentro do animal, para que eles devem ter uma camada muito fina de cola. Permitir que a cola secar por pelo menos 3 horas. </li><li> Encurtar o fim de 1 centímetro de comprimento de um eletrodo diferencial a dois centímetros. Em cada fio, retire um centímetro de silicone e esmalte. Enrolar um fio desencapado em um gancho para a gravação. Dobre o outro fio para cima e longe do gancho, o que servirá de fio terra. Repita o procedimento para os restantes três eletrodos. </li><li> Selecionar um dos quatro eletrodos na extremidade de 2 polegadas. Use uma pinça para raspar silicone e esmalte, expondo uma centímetros de fio de aço inoxidável nua em cada um dos dois fios. Conector de solda de ouro a cada um dos dois fios. Use um pedaço de fita de laboratório para garantir o fim e manter uma separação entre o solo e os pinos de gravação. Repita o procedimento para os restantes três eletrodos. </li><li> Anexar uma bola de 1-2cm da cola de silicone para o cabo, cerca de 1,5 cm da extremidade do gancho para ancorar os eletrodos dentro do animal. Deixe secar por pelo menos uma hora (Figura 1D). <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fabricação Assembléia Electrode. (A) eletrodo único diferencial consiste de um fio dobrado e torcido, com suas extremidades presa com fita adesiva. (B) Dois eletrodos diferenciais torcidos juntos, deixando espaço sem torção nas extremidades. Fita de cor diferente ou outra marcação deve ser usado para identificar as extremidades. (C) Todos os eletrodos diferenciais quatro combinados em um único conjunto de eletrodos formando um único cabo, com filiais em separado dos eletrodos individuais em cada extremidade, marcados com cores distintas da fita. (D) a forma final da montagem do eletrodo. À esquerda, há enrolado ganchos para gravações e fios de aterramento para cada eletrodo diferencial. À direita, pinos de ouro foram soldados aos fios para conexão com o amplificador. Uma bola de ancoragem de cola de silicone também foi colocado para o lado esquerdo da assembléia. </li></ol> 2. Preparação de animais para Implantação <ol><li> Selecione um animal saudável, que pesa cerca de 350-450g. Em resposta a pequenos pedaços de algas, o animal deve gerar mordidas em intervalos de 3 a 5 segundos. A cirurgia completa com implante de eletrodos deve levar cerca de uma hora. </li><li> Para anestesiar o animal, injetá-lo com 30% w / v isotônica MgCl 2. Para evitar a perda de hemolinfa e MgCl 2, o local da injeção podem ser revestidos em superglue antes de remover a agulha. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Diagrama esquemático mostrando como o animal é fixado para a implantação de eletrodos, ea localização da incisão (indicado por um bar). </li><li> Coloque o animal anestesiado em uma bandeja de dissecação com o seu pé para baixo. De frente para a cabeça de animal em diante, deslocar a área de emalhar para o tal esquerda que o animal é parcialmente de lado, se inclinando para longe. Pino para baixo os tentáculos anterior (Figura 2). </li><li> Coloque a bandeja sobre o estágio de um microscópio de dissecação. Escorar a bandeja em um ângulo de 20 graus para elevar a cabeça e recolher o hemolinfa na cauda, ​​longe da incisão. </li><li> Com uma tesoura de dissecção, iniciar uma incisão ligeiramente para a direita do eyespot e estendê-lo 1 a 1,5 cm anteriormente. Use retratores anexado às bordas da bandeja para manter a incisão aberta (Figura 2; bar nota perto incisão eyespot indicando). </li><li> Para expor a massa bucal, utilize uma pinça para levantar a membrana transparente por baixoa pele e use a tesoura para cortar uma abertura correspondente a incisão principal. Tuck as bordas da membrana para os afastadores. </li></ol> 3. Implantação de eléctrodos <ol><li> Coloque o conjunto do eletrodo em um micromanipulador e movê-lo ao longo da incisão do animal. </li><li> O nervo radular é mais difícil acesso, e devem ser abordados em primeiro lugar. Existem duas opções para acessar o nervo radular. </li><li> A primeira opção, que é preferível, é olhar sob o gânglio bucal entre BN1 e BN2. Se um ramo do nervo radular é visível, use uma pinça de ponta fina dobrado em um gancho para levantar o ramo (Figura 3, alça de RN sob gânglio rotulados 1). </li><li> Se um ramo do nervo radular não é acessível acima do músculo, a segunda opção é para acessá-lo através de uma pequena incisão na I2 ao lado do tecido conjuntivo na base do gânglio vestibular (Figura 3, RN abaixo do músculo rotulados 2). A incisão na I2 deve passar por duas camadas de músculo I2. Segure a borda da incisão do músculo com uma pinça em linha reta e use a pinça para retirar enganchado um ramo RN. </li><li> Enquanto mantém o nervo com a pinça viciado, use um conjunto diferente de uma pinça para manipular o gancho eletrodo para o nervo. </li><li> Use o micromanipulador para levantar o gancho para que o nervo é levantado fora da massa bucal e desembaraçadas de quaisquer outros nervos ou tecido. Evite esticar o nervo. </li><li> Seque o eletrodo usando um Kim-Wipe ou sucção fora o excesso de líquido com uma seringa. Tensão de água pode causar a coragem de colapso sobre si mesmo, ou um selo de água para formar com o nervo. Em ambos os casos, a área deve ser completamente seca antes de cola é aplicada. </li><li> Aplique uma pequena bagatela de super cola onde a base do gancho entra em contato com a parte inferior do nervo. Aplique uma gota de solução salina ou Aplysia hemolinfa para definir a supercola. Quando a cola não é nada molhado deve ser movida como a obtenção de cola entre o fio eo nervo bloquearia a conexão elétrica. </li><li> Seque o gancho novamente. Mix cola Kwik-Sil em um bloco de gelo. </li><li> Use a ponta de um alfinete para aplicar uma pequena quantidade da cola Kwik-Sil, cobrindo completamente qualquer fio exposta do gancho, mas não o fio terra. </li><li> Permitir a cola para definir por aproximadamente 5 minutos, reajustando a cola se afasta das seções do gancho. A cola é definida quando ele adere já não quando tocado com o pino (Figura 4 mostra a configuração final). </li><li> Uma vez que o eletrodo nervo radular está definido, o músculo I2 pode ser acessado. Na área entre BN1 e BN2, use a pinça agarrado ao anzol e para separar duas bandas do músculo I2 do resto do músculo puxando para cima as bandas. Anexar o eletrodo usando o mesmo procedimento. </li><li> Nervos bucal 2 e 3 são facilmente acessados ​​e os eletrodos são fixados com o mesmo procedimento. </li><li> Uma vez que todos os eletrodos são conectados, deslize o conjunto de eletrodos dentro do animal até a âncora silicone. </li><li> Suturar a incisão fechada em torno do cabo eletrodo salientes, mantendo a âncora dentro do animal. Supercola os pontos para garantir uma boa vedação. </li><li> Insira as pontas de conector de ouro na outra extremidade do eletrodo em um pequeno bloco de isopor. Devolver o animal para o tanque principal em um recipiente de isolamento aerado para pernoite de recuperação. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Um diagrama do aparelho de alimentação Aplysia conhecida como a massa bucal. Mostrados são os nervos bucal (BN1, BN2, BN3), o nervo radular (RN), que sai do fundo do gânglio vestibular, então mergulha abaixo do músculo, ea localização sobre o músculo I2 onde o eletrodo está conectado. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Esquema do eletrodo único anexado a um nervo (ou músculo) e colado no lugar. Note-se que a região de isolamento do gancho ondulado está em contato direto com o nervo (ou músculo), ancorado no lugar com supercola, e eletricamente isolados do meio fluido usando Kwik-Sil. Note também que a ponta do eletrodo deinsulated solo é exposto ao meio fluido. 4. Gravação <ol><li> Aclimatar o animal em um recipiente arejado quando estiver ligado ao equipamento de gravação de pelo menos 1,5 horas. Monitorar o sinal enquanto o animal está se aclimatando para verificar se todos os eletrodos estão funcionando e que os níveis de ruído são baixos. </li><li> Use uma câmera de vídeo para registrar o comportamento alimentar durante o uso do computador para gravar sinais dos eletrodos neural e muscular. Sincronizar o vídeo e as gravações do eletrodo usando um sinal de onda quadrada que controla um contador digital na visualização da câmera enquanto é simultaneamente registrada como um canal adicional no computador Axoscope. </li><li> Alimentação comportamentos são extraídas pelas técnicas dedescrito na Morton e Chiel 1993. </li></ol> Embora os animais invertebrados não exigem aprovação formal por um uso de animais institucional e da comissão de cuidados, temos assegurado que todos os tratamentos de Aplysia minimizar os danos e sofrimento para o animal, e que todas as técnicas cirúrgicas são feitas enquanto o animal está totalmente anestesiado. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. (A) de quatro canais simultâneos gravações de um músculo (o músculo transferidor I2), e de três nervos bucal (o nervo radular, RN, bucal do nervo 2, BN2 e nervo bucal 3, BN3) durante uma resposta de deglutição. (B) Um quadro ainda da gravação de vídeo simultâneas do animal livremente se comportando como se engole uma tira de alga precut (0,5 cm de largura), que foi marcado em intervalos de 0,5 cm, com faixas brancas para que seus movimentos podem ser facilmente visualizados como o animal se alimenta.

<ol>
	<li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia.">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).</li><li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia.">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).</li><li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+chronic+single+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes.">A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).</li><li>Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nbsp;Neuromechanics+of+multifunctionality+during+rejection+in+Aplysia+californica.">nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica.</a> J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).</li></ol>

A principal inovação que fez estas gravações de sucesso é a combinação dos eletrodos em um único cabo. Duas gravações eletrodo tem sido utilizado antes, mas expandindo para quatro eletrodos individuais resultou na formação de aderências cirúrgicas, que muitas vezes impediu o animal de fazer movimentos de alimentação normal. Combinando os eletrodos em um cabo reduz a maior parte dos eletrodos dentro do animal, que por sua vez reduz a resposta imune e permite que o animal se mover mais livremente. <p c...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Enamel coated stainless steel wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>California Fine Wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.001D, coating h</td>
</tr>
<tr>
<td>Household Silicone II Glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Sil Adhesive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Duro Qwik-Gel superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henkel corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>A-M Systems model 1700 amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A-M Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle</td>
</tr>
<tr>
<td>Axoscope 10.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gold Connector Pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bulgin</td>
<td>SA3148/1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gold Connector Sockets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bulgin</td>
<td>SA3149/1</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrode fabrication and implantation in aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals

Gravar a partir de nervos e músculos da chave<em&gt; Aplysia</em&gt; Durante o comportamento alimentar nos permite estudar os padrões de controle neural em um animal intacto. Registra, simultaneamente, múltiplos nervos e músculos nos dá informações precisas sobre o momento da atividade neural. Métodos de gravação anterior ter trabalhado por dois eletrodos, mas o estudo de nervos ou músculos adicionais necessários combinando e média das gravações de vários animais, o que tornava difícil determinar detalhes de tempo e eliminação, devido à variabilidade da resposta à resposta e, a partir animal para animal. Implantação de quatro eletrodos indivíduo tem uma taxa de sucesso muito baixa, devido à formação de aderências que impeçam os animais de executar movimentos de alimentação normal. Nós desenvolvemos um novo método de fabricação de eletrodos, que reduz o volume dos eletrodos dentro do animal permitindo movimentos alimentação normal. Usando uma combinação de colas para fixar os resultados eletrodos em um isolamento mais confiável do eletrodo, que dura mais tempo, tornando possível recorde para períodos de até uma semana. A técnica de fabricação que descrevemos poderia ser ampliado para incorporar vários eletrodos adicionais, e seria aplicável a animais vertebrados.

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Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A técnica é descrita para a implantação de quatro<em&gt; In vivo</em&gt; Eletrodos para monitorar o controle neuromuscular do comportamento alimentar em<em&gt; Aplysia californica</em&gt;.

Fabricação de eletrodos e Implantação de Aplysia californica Para gravações multi-canal neural e muscular na Intact, Animais Livremente Behaving

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

electrode-fabrication-implantation-aplysia-californica-for-multi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

13.0K visualizações.  Case Western Reserve University. A técnica é descrita para a implantação de quatro In vivo Eletrodos para monitorar o controle neuromuscular do comportamento alimentar em Aplysia californica.

Vídeo: Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a noninvasive brain monitoring tool in cognitive neuroscience as well as a diagnostic tool for epilepsy and sleep disorders in neurology. However, the underlying mechanism of EEG rhythm generation is still under the veil. Recently introduced polyimide-based microelectrode (PBM-array) for high resolution mouse EEG1 is one of the trials to answer the neurophysiological questions on EEG signals based on a rich genetic resource that the mouse model contains for the analysis of complex EEG generation process. This application of nanofabricated PBM-array to mouse skull is an efficient tool for collecting large-scale brain activity of transgenic mice and accommodates to identify the neural correlates to certain EEG rhythms in conjunction with behavior. However its ultra-thin thickness and bifurcated structure cause a trouble in handling and implantation of PBM-array. In the presented video, the preparation and surgery steps for the implantation of PBM-array on a mouse skull are described step by step. Handling and surgery tips to help researchers succeed in implantation are also provided.

In this article, we described the surgery procedure and handling tips for implantation of ultra-thin polyimide-based microelectrode array (PBM-array) on the mouse skull for acquisition of high-density encephalography (EEG) in a mouse model.

Gravações de alta densidade EEG dos Ratos movimentando-se livremente usando Polyimide baseado microeletrodos

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Neurociência

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Concepção e montagem de um Microdrive Ultra-leve motorizada para doenças crônicas Recordings Neurais em Pequenos Animais

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Preparação para divulgação e gravação de programas de alimentação do motor com movimentos fisiológicos em<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracelularmente Identificar os neurônios motores de um pool do motor muscular em<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Um Procedimento para Implantação de Arrays organizado de microfios para gravações a única unidade em Awake, comportando-se Animais

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic targeting for microcircuit dissection and disease modeling. The introduction of optogenetics, for example, has allowed for bidirectional manipulation of genetically-identified neurons, at an unprecedented temporal resolution. To capitalize on these tools and gain insight into dynamic interactions among brain microcircuits, it is essential that one has the ability to record from ensembles of neurons deep within the brain of this small rodent, in both head-fixed and freely behaving preparations. To record from deep structures and distinct cell layers requires a preparation that allows precise advancement of electrodes towards desired brain regions. To record neural ensembles, it is necessary that each electrode be independently movable, allowing the experimenter to resolve individual cells while leaving neighboring electrodes undisturbed. To do both in a freely behaving mouse requires an electrode drive that is lightweight, resilient, and highly customizable for targeting specific brain structures.
A technique for designing and fabricating miniature, ultralight weight, microdrive electrode arrays that are individually customizable and easily assembled from commercially available parts is presented. These devices are easily scalable and can be customized to the structure being targeted; it has been used successfully to record from thalamic and cortical regions in a freely behaving animal during natural behavior.

Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.

Projeto e fabricação de Ultraleve Peso, ajustável Sondas Multi-eletrodo para gravações eletrofisiológicas em Ratos

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Visual Evoked Potential Recordings in Mice Using a Dry Non-invasive Multi-channel Scalp EEG Sensor

For scalp EEG research environments with laboratory mice, we designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable because of the plunger-spring-barrel structural facet and mechanical strengths resulting from metal materials. The whole process for acquiring the VEP responses in vivo from a mouse consists of four steps: (1) sensor assembly, (2) animal preparation, (3) VEP measurement, and (4) signal processing. This paper presents representative measurements of VEP responses from multiple mice with a submicro-voltage signal resolution and sub-hundred millisecond temporal resolution. Although the proposed method is safer and more convenient compared to other previously reported animal EEG acquiring methods, there are remaining issues including how to enhance the signal-to-noise ratio and how to apply this technique with freely moving animals. The proposed method utilizes easily available resources and shows a repetitive VEP response with a satisfactory signal quality. Therefore, this method could be utilized for longitudinal experimental studies and reliable translational research exploiting non-invasive paradigms.

We designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable. This paper describes the whole process from manufacturing the proposed EEG electrode to signal processing of visual evoked potential (VEP) signals measured on a mouse scalp using a dry non-invasive multi-channel EEG sensor.

Gravações de potenciais evocadas visuais em ratos usando um não-invasivo seco multi-canal do couro cabeludo Sensor de EEG

For scalp EEG research environments with laboratory mice, we designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local, eletrocardiograma, eletromiograma e respirar o ritmo de um rato andando livremente

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...