Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento, e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) para apoiar este trabalho. MT foi apoiado por uma bolsa da Fundação Centro TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution (CMDE).

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	<li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+yeast+in+biotechnology:+protein+production+and+genetic+analysis.">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li><li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations.">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris.">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li><li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris.">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li></ol>

Expressão da proteína usando a levedura Pichia pastoris metilotróficas como um sistema host é descrita neste protocolo. A proteína pode ser secretado para o meio, dependendo do vector de clonagem usado. A secreção da proteína recombinante faz a purificação subseqüente mais fácil. No entanto, as condições mostradas podem ter que ser otimizado para a expressão de proteínas diferentes e mudanças nas condições e tempos de expressão pode resultar em níveis de proteínas. O vetor utilizado neste ...

expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris

Expressão da proteína na Pichia pastoris eucarióticas anfitrião microbiana oferece a possibilidade de gerar grandes quantidades de proteína recombinante em um sistema de expressão rápida e fácil de usar. Como um microorganismo unicelular P. pastoris é fácil de manipular e cresce rapidamente em meios baratos em altas densidades celulares. Ser um eucariota, P. pastoris é capaz de executar muitas das modificações pós-translacionais executada por células eucarióticas e as proteínas recombinantes obtidas sofrer dobramento de proteínas, processamento proteolítico, formação da ligação dissulfeto e glicosilação [1]. Como um metilotróficas levedura P. pastoris é capaz de metabolizar metanol como única fonte de carbono. O promotor forte para oxidase de álcool, AOX1, é estreitamente regulada e induzidos pelo metanol e é usado para a expressão do gene de interesse. Assim, a expressão da proteína estranha pode ser induzida pela adição de metanol ao meio de crescimento [2, 3]. Outra vantagem importante é a secreção de proteína recombinante para o meio de crescimento, usando uma seqüência de sinais como alvo a proteína estranha à via de excreção de P. pastoris. Com apenas baixos níveis de proteína endógena secretada à mídia pela levedura em si e não proteínas adicionadas aos meios de comunicação, uma proteína heteróloga constrói a maioria das proteínas totais no médio e facilita seguintes etapas de purificação de proteínas [3, 4]. O vetor usado aqui (pPICZαA) contém o promotor AOX1 para bem regulamentada, a expressão de metanol induzida do gene de interesse; o sinal de secreção de α-fator para a secreção da proteína recombinante, um gene de resistência Zeocin para a seleção em ambos os E. coli e Pichia e um peptídeo C-terminal contendo o epítopo c-myc e um polyhistidine tag (6xHis) para a detecção e purificação de proteína recombinante. Mostramos também a análise de western blot a proteína recombinante usando o anticorpo anti-myc-HRP específica reconhecendo o epítopo c-myc no vetor pai.

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Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

O protocolo descreve a expressão da proteína utilizando a levedura metilotróficas<em&gt; Pichia pastoris</em&gt;. A preparação de células de levedura electrocompetent, a transformação do vetor com o gene de interesse em<em&gt; P. pastoris</em&gt; E purificação do DNA de levedura também são realizados. Ocidental blot e purificação de proteínas construir os últimos passos neste protocolo expressão da proteína.

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

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Research

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Biology

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

45.6K visualizações.  University of British Columbia - UBC. O protocolo descreve a expressão da proteína utilizando a levedura metilotróficas Pichia pastoris. A preparação de células de levedura electrocompetent, a transformação do vetor com o gene de interesse em P. pastoris E purificação do DNA de levedura também são realizados. Ocidental blot e purificação de proteínas construir os últimos passos neste protocolo expressão da proteína.