Agradecemos a membros do laboratório Rosenblatt para discussões científicas, sugestões e comentários. Gostaríamos também de agradecer a Mary Halloran, que gentilmente nos cedeu o plasmídeo RFP-UtrCH e David Grunwald que forneceu o CK: GFP transgênicos zebrafish. Obrigado também a Gretchen Rei e do pessoal da Resource Zebrafish centralizado na Universidade de Utah para excelente manutenção e cuidados com o peixe-zebra. Este trabalho foi financiado pelo NIH-Award NIGMS NIH Director do New Innovator uma DP2 OD002056-01 a JR. GTE foi apoiado pelo NIH Multidisciplinar de Câncer Programa de Treinamento Grant 5T32 CA03247-8.

Fluxo básico para a visualização de Actina Dynamics durante a extrusão celular na epiderme Zebrafish desenvolvimento A epiderme do peixe-zebra em desenvolvimento é composto de duas camadas distintas, a camada de superfície (ou periderme) e uma camada basal de células que o contato da membrana basal 2. As células da camada de superfície externa sofrem apoptose e são eliminados a partir do tecido por extrusão 3 (Figura 1). Para visualizar este processo em tempo real, injetamos RNA codificação de proteínas fluorescentes vermelhas fundida ao domínio de homologia calponin de utrophin, uma proteína de ligação de actina (RFP-UtrCH) 4,5, em uma única célula-estágio zebrafish transgênicos expressando a proteína fluorescente verde (GFP ) sob o epitélio estratificado promotor citoqueratina 8 6 (Figura 2A). Embora RFP-UtrCH é onipresente expressa no animal após a injeção de RNA, vamos nos concentrar nas células superficiais da epiderme, que expressam tanto RFP e GFP para seguir actina dinâmica especificamente na epiderme (Figura 2B). Em seguida, tratar as larvas com G418 para induzir a extrusão celular por apoptose e imagem os filamentos de actina epiderme e usando um microscópio confocal disco giratório e adquirir conjuntos de dados 4D. Antes do início do experimento <ol><li> In vitro transcrever o RNA a partir de um modelo de DNA linearizado usando o mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) e purificar o RNA capped usando o RNeasy Mini kit (Qiagen). Diluir o RNA para ~ 60ng/ul usando água estéril, fazer 3-5μl alíquotas e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para a injecção. Nota: Evite congelar repetitivos / descongelamento para evitar a degradação do RNA. </li><li> Fazer um molde para segurar os embriões durante a injeção por vazamento 40mL de agarose 2% em meio embrião E3 (E3) em uma placa de cultura 100 x 15mm e colocar um molde de microinjeção (Ferramentas Adaptive Ciência, # I-34) neste tabuleiro. Uma vez que a agarose solidificou, remover o molde para expor os bebedouros na agarose. Armazenar a placa a 4 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Puxar agulhas para injeção capilar utilizando vidro de borosilicato com filamentos (OD 1.0mm, ID 0,78, 10cm) e um Sutter Puller Pipetar P-97 em as seguintes configurações (Heat 485, Pull 50, Velocity 60, Delay / Time 90, Pressão 200 ). Nota: Diferentes tipos de vidro exigirá otimização das condições listadas. </li><li> Compõem 1% Low Melt (LM) em 1mL agarose alíquotas E3 e armazenar a 42 ° C. Tenha cuidado, pois a evaporação da E3 dos estoques pode aumentar a concentração de agarose. </li><li> Manter peixe-zebra adulto em condições de laboratório padrão, com um regular ciclo claro / escuro de 14 horas luz e 10 horas de escuridão 7. A noite antes do experimento configurado peixes para acasalar, colocando três fêmeas e dois machos em um tanque separado por uma divisória. Na manhã seguinte, trocar a água no tanque e puxar o divisor quando as luzes se acendem. </li></ol> 1. Injeção de RNA codifica a proteína actina fluorescente Tagged Binding <ol><li> Descongelar o RNA no gelo. Adicionar 0,5% de fenol vermelho para o RNA em uma proporção de 1:1 para uma concentração final de RNA ~ 30ng/μl e carga solução 1μl em uma agulha puxado capilar por volta de enchimento. </li><li> Coletar ~ 75 1 célula-stage 8 CK: embriões GFP na E3. Pipeta coletadas de embriões no molde microinjeção com uma pipeta Pasteur 5 ¾ e gentilmente orientar os embriões no cocho com FST Dumont # 5 fórceps. Nota: Tome cuidado para trabalhar com rapidez para evitar injetar um embrião palco multi-celular, o que pode resultar na expressão mosaico da RNA injetado. </li><li> Sob um estereomicroscópio padrão de laboratório de dissecação, injetar o RNA para a gema dos embriões usando um microinjetor pressão controlada (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-Injector). A mancha vermelha (vermelho de fenol) devem ser visíveis no embrião após a injeção. Injetar pelo menos 50 embriões para cada experimento. (Veja o protocolo JOVE anterior para um protocolo detalhado sobre RNA de injeção em embriões de peixe-zebra 9). Nota: <ol type="A"><li> Um volume de ~ 2nl deve ser usado para injeção de RNA em uma célula de embriões palco. Para determinar a quantidade de RNA injetado, dispensar um bolo do RNA em uma gota de óleo mineral em um micrómetro calibrado ou sob um microscópio com uma barra de escala construída pelas oculares. A gota de RNA deve ser uma esfera perfeita. Calcule a quantidade entregue usando a equação: Volume (em nl) = 4/3πr 3. Ajustar o volume entregue, alterando a pressão de injeção ou o tempo no instrumento. </li><li> Cuidados também devem ser tomadas para injetar a menor quantidade de RNA que permite a visualização do fluoróforo, como altas concentrações de RNA podem ser tóxicos para o embrião em desenvolvimento. Para determinar o nível de expressão apropriada, um experimento de dose-curva deve ser feita antes de executar o experimento. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Classificar os embriões para remover quaisquer ovos não fertilizados ou danificados e colocar todos os embriões restantes de 28,5 ° C. </li><li> Após 24 horas, use um microscópio de fluorescência de dissecação para selecionar embriões zebrafish que têm um alto nível de GFP (epiderme) e fluorescência RFP (actina). Coloque os embriões selecionados em 28.5 ° C até que esteja pronto para prosseguir com o tratamento medicamentoso para induzir a apoptose. </li></ol> 2. Indução de extrusão celular em larvas do peixe usando G418 Descobrimos que a exposição aos antibióticos aminoglicosídeos G418, ou Geneticin, faz com que a apoptose e extrusão de células epidérmicas no desenvolvimento de larvas do peixe 3 por um mecanismo desconhecido. Importante, esse tratamento só funciona em larvas que são 4 dias após a fertilização e mais velhos. Vemos que ~ 5-25 células podem ser encontradas extrusão, em determinado momento da fin epiteliais G418 zebrafish tratados larval. Como a quantidade de células apoptóticas extrusão pode variar de peixe para peixe, recomendamos a montagem de peixe múltiplas para imagem. <ol><li> Recolher e colocar 4 fertilização pós-dia (dpf) larvas de peixe-zebra exibindo tanto GFP e RFP fluorescência em uma placa de cultura 35 x 10mm contendo três mililitros (ml) da E3. Pode-se tratar até 25 larvas em cultura este prato tamanho. </li><li> Recolocar cuidadosamente os meios de comunicação com 3mls de 1mg/mL contendo E3 de G418 e incubar larvas na droga durante 4 horas a 28,5 ° C. Note-se que G418 é sensível à luz, por isso tome cuidado para manter o prato de cultura, recobertos ou no escuro. </li><li> Remova a mídia e substituir com pré-aquecido 28,5 ° C media E3 contendo tricaina 0,02% e proceder à montagem das larvas. </li></ol> 3. Larvas Zebrafish montagem for Imaging <ol><li> Transferência de três larvas para um tubo eppendorf 1,5 ml e remover a maioria da E3 após o dissipador de peixe até o fundo do tubo. Descobrimos que até 3 animais pode ser montada corretamente antes da agarose solidifica. </li><li> Usando a ponta da pipeta corte, 120ul pipeta de 1% LM-agarose (42 ° C) dentro do tubo, misturar, e então suavemente pipeta as larvas e mistura de agarose para a lamínula no fundo de um prato de cultura Mattek. </li><li> Usando um titular FST pino com um pino de inserção ou de tungstênio agulha acoplada, de forma rápida orientar as larvas para que eles estão em linha reta e plana contra a lamela do prato Mattek. Nota: Normalmente usamos um alfinete para orientar o primeiro larvas e, em seguida, um pino em forma de L para garantir que eles são planas contra a lamela, evitando danos aos espécimes. </li><li> Uma vez que a agarose solidificou, gentilmente encher o prato com E3 contendo 0,02% tricaina. Nota: Como alternativa, G418 pode ser adicionado à E3 no prato de imagem para continuar a extrusão de indução, apesar de longo prazo da exposição a 1mg/mL G418 vai matar as larvas. </li></ol> 4. Imagens ao vivo de Actina Dynamics and Individual Comportamentos de células epiteliais durante a extrusão celular usando um Microscópio Confocal Spinning Disc Nós descobrimos que todo o processo de extrusão de células apoptóticas da epiderme de desenvolvimento de larvas do peixe leva aproximadamente 20 minutos 3. Aqui demonstramos como configurar uma experiência de imagens de lapso de tempo para coletar uma série de planos z através de uma única camada da epiderme zebrafish para visualizar o processo de extrusão. Descobrimos que microscópios fluorescentes típicas Widefield causa significativa fotodegradação dos filamentos de actina e não permitem imagens timelapse. Portanto, para maximizar a nossa resolução e prevenir a fotodegradação, nós usamos um microscópio confocal disco giratório. Abaixo descrevemos como configurar o experimento usando o software de QI Andor com um microscópio Nikon, embora os princípios discutidos podem ser aplicadas para microscópio semelhante set-ups. <ol><li> Primeiro, ligue o Argon (para excitação do GFP em 488nm) e HeNe (para excitação do RFP em 561nm) lasers, microscópio de câmara, e lâmpada de epifluorescência. </li><li> Dentro do IQ Andor software (versão 1.10.1), criar um protocolo de séries temporais contendo os comprimentos de onda que você quer para a imagem, a freqüência dos intervalos entre captura de imagem eo número de vezes a captura deve ser repetido. </li><li> Delicadamente, coloque o prato Mattek contendo o seu exemplar no palco e usar um microscópio 20x objetivo com luz transmitida para focar as larvas. </li><li> Mover a objetiva de imersão 40X de água (NA 0,8) para a posição correta. Usando este objectivo, podemos filme aproximadamente 20-25 células por campo, o que nos permite seguir comportamentos celulares durante a extrusão e ao mesmo tempo resolver dinâmica sub-celular de actina. Nota: A montagem mesmo e estratégias de imagem pode ser aplicada a microscópios de pé, apesar de uma objetiva de imersão 40X de água com uma longa distância de trabalho deve ser usado. </li><li> Com cuidado, coloque uma gota de água no topo da objetiva de 40x e colocar rapidamente o prato Mattek por cima. Nãoe: Zeiss solução de imersão Immersol também pode ser usado se a evaporação da água é um problema. </li><li> Identificar a amostra, utilizando fase ou iluminação DIC e use epifluorescência 488nm a concentrar-se especificamente sobre a epiderme GFP positivas. </li><li> Alternar para o modo de varredura confocal. Ajustar a intensidade do laser e do tempo de exposição para cada um dos canais (488nm e 561nm) em conformidade. Tome cuidado para equilibrar a potência do laser eo tempo de exposição ideal para a detecção do sinal e impedir qualquer fotobranqueamento ou toxicidade. </li><li> Para identificar as células de extrusão, use epifluorescência para visualizar a GFP rotulados epiderme e identificar um grupo de células em um padrão clássico de roseta, que consiste em um conjunto de células em torno de uma pequena cela redonda no meio. Usando o modo de varredura confocal, também deve haver um acúmulo de actina RFP marcado visível como um anel em torno da célula pequena e redonda no meio, uma marca de extrusão celular. Depois de ter identificado uma célula de extrusão, configurar rapidamente o microscópio para adquirir 4D (XYZ-Time) datasets confocal. </li><li> Definir os pontos superior e inferior dentro do plano z para visualizar uma única camada da epiderme, incluindo a célula de extrusão, e selecione o tamanho do passo. Por lapso de tempo de imagem, definir os intervalos para captura de imagem eo número de repetições. Por exemplo, nós tipicamente adquirir um z-series abrangendo 5 10μm, com um tamanho do passo 1 mícron, a cada 1-2 minutos para 30 minutos. </li><li> Para visualizar os dados, que normalmente fazem projeções 3-D da série z e salvar o conjunto de dados como um arquivo de filme que é compatível com o Quick Time (Apple). Desta forma, podemos visualizar a contração do anel de actina e comportamentos epiteliais que ocorrem em torno da célula morrendo ao longo do tempo. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquemático de extrusão celular por apoptose. Filamentos de actina são mostrados em vermelho, GFP positivas células epidérmicas são verdes. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Fluxo de trabalho experimental. A. Esquema do fluxo de trabalho para o experimento. B. Expressão de RFP-UtrCH na epiderme de um CK 4dpf: GFP zebrafish. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Ainda frames (z-projeções) de um filme de lapso de tempo que se segue ao vivo actina dinâmica durante o processo de extrusão de células epiteliais. Setas indicam o anel de actina formado por células vizinhas que os contratos e fecha durante o curso de 2 minutos.

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

Garantia de animais do Bem-Estar Todos os procedimentos realizados neste protocolo com o paulistinha, Danio rerio, foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade de Utah (Animal Welfare Assurance # 10-07017).

O protocolo aqui descrito demonstra um método simples e direta para visualizar o processo de extrusão em um tecido vivo epiteliais. Este tipo de experimento nos permite examinar sutilezas de actina dinâmica antes não apreciada em análises de tecido fixado, e, portanto, complementa métodos comuns de imunofluorescência. Podemos usar este protocolo, em combinação com inibidores químicos ou mutantes genéticos para analisar melhor o processo de extrusão e estados de doença estudo associado à falha de remover e ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Tipo </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reagente </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reagente </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Tanques travessia </td><td> Ferramenta </td><td> Thoren Sistemas Aquáticos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A bomba de Pipetar </td><td> Ferramenta </td><td> Art Bel Produtos </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ Pipete Pasteur </td><td> Ferramenta </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Mold microinjeção </td><td> Ferramenta </td><td> Ferramentas Adaptive Ciência </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> Placa 100x15mm Cultura </td><td> Ferramenta </td><td> Pescador </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipeta Puller </td><td> Ferramenta </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Modelo P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidro com filamento </td><td> Ferramenta </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, ID 0,78 milímetros, comprimento 10 centímetros </td></tr><tr><td> Jar Armazenamento eletrodo </td><td> Ferramenta </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Vermelho de fenol </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% em DPBS </td></tr><tr><td> Pressão controlada microinjetor e micromanipulador </td><td> Ferramenta </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> Dish Cultura 35x10mm </td><td> Ferramenta </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> Reagente </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / mL em dH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinça </td><td> Ferramenta </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12 centímetros Titular Pin </td><td> Ferramenta </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Inserir Pinos </td><td> Ferramenta </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 26007-02 e-03 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro Dish Cultura inferior com 1,5 lamela </td><td> Ferramenta </td><td> Mattek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Low Melt Agarose </td><td> Reagente </td><td> Pescador </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaina </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação </td><td> Microscópio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação </td><td> Microscópio </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescentes microscópio de dissecação </td><td> Microscópio </td><td> Olimpo </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Confocal Spinning Disc </td><td> Microscópio </td><td> Nikon </td><td> Eclipse Ti </td><td> Equipado com uma cabeça girando disco Yokagawa </td></tr><tr><td> CCD Camera </td><td> Câmera </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micron pixels quadrados </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

Manutenção da homeostase dos tecidos epiteliais requer a remoção contínua de células danificadas, sem interromper a função de barreira. Nossos estudos descobriram que as células morrem enviar sinais para seus vizinhos ao vivo para formar e contratar um anel de actina e miosina que ejeta-lo para fora da folha epiteliais ao fechar eventuais lacunas que possam ter resultado de sua saída, um processo chamado de extrusão de células 1. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos um método para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval. Para visualizar extrusão, injetamos uma sonda de proteína vermelha fluorescente etiquetados para F-actina em uma única célula de embriões em estágio zebrafish transgênicos expressando a proteína verde fluorescente na epiderme e induzir a apoptose através da adição de G418 para as larvas. Em seguida, usamos lapso de tempo imagem em um microscópio confocal disco giratório de observar a dinâmica de actina e comportamentos de células epiteliais durante o processo de extrusão celular por apoptose. Essa abordagem nos permite investigar o processo de extrusão em viver epitélios e irá fornecer uma avenida para estudar estados de doença causada pela incapacidade de eliminar as células apoptóticas.

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Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Células que morrem são extrudados a partir de tecidos epiteliais pela contração concertada de células vizinhas, sem interromper a função de barreira. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos métodos para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval em resolução celular.

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

live-imaging-cell-extrusion-from-epidermis-developing

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K visualizações.  University of Utah. Células que morrem são extrudados a partir de tecidos epiteliais pela contração concertada de células vizinhas, sem interromper a função de barreira. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos métodos para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval em resolução celular.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.