Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (Grant no. DBI 0.519.984) e os Institutos Nacionais de Saúde (Grant no. 5R01GM078279) ..

1) Preparação do material vegetal <ol><li> Protoplastos pode ser derivado de muitas espécies de plantas diferentes e tecidos, desde que a mistura certa de parede celular enzimas digestivas é utilizado 1. Antes de um experimento em larga escala é realizada, a digestão de pequena escala do material é aconselhável, a fim de avaliar a eficiência protoplasting do tecido, enzimas, etc, e para estimar as células por cento positivo para separação de células. Aqui, protoplastos derivados das raízes de mudas de Arabidopsis thaliana que tipo de célula, especificamente expressam a proteína verde fluorescente (GFP) são usados. A endoderme e do centro de repouso são marcadas por P SCR:: GFP e do centro quiescente por P WOX5:: GFP 2,3 (Figura 1). </li><li> Mudas são cultivadas em sistema hidropônico em phytatrays (Sigma; Figura 2a) em um filtro de nylon (malha 250 mm; NITEX) que permite que as raízes crescem através no meio de crescimento (0,22% w / v Murashige e Skoog Médio Basal [Sigma], 1% w / v de sacarose, 0,05% w / v MES [2 - (N-morfolino) ácido ethanesulfonic], pH 5,7 com KOH). Alternativamente, as plantas podem ser cultivadas em cima de um filtro de nylon (100 mesh mm) posicionados verticalmente em placas de ágar 1% (Figura 2b). </li><li> O uso dos filtros acima referidos, não só ajuda na colheita das raízes, ele também facilita o tratamento adicional fácil das mudas, se desejar. Os filtros permitem que as mudas a serem transferidos em massa para phytatrays novo ou placas de ágar suplementado com um catalisador de interesse. Por exemplo, o conjunto phytatray até tem sido utilizado para análise de células de tipo específico da resposta transcricional a tratamento de nitrogênio em mudas de Arabidopsis 4. </li><li> Microscopicamente garantir que o seu marcador fluorescente é corretamente expressa (especialmente quando se utiliza a opção de tratamento, como a célula tipo específico marcadores si pode ser influenciada pelo tratamento). Neste caso, as mudas são inspecionadas no microscópio de fluorescência (Nikon; Figura 1). Note-se que células de tipo específico linhas marcador fluorescente deve ser caracterizada inicialmente sob um microscópio confocal para determinar exatamente que tipos de células são marcadas e determinar a variabilidade de expressão. </li></ol> 2) Preparação da solução protoplasting <ol><li> Dissolver 1,25% w / v celulase (Yakult), 0,3% w / v Macerozyme (Yakult), 0,4 M D-manitol, 20 mM MES e 20 mM KCl (a partir de um estoque de M 1) em água desmineralizada e ajustar o pH para 5,7 com 1 M Tris / HCl pH 7.5. Esta solução será ligeiramente turvo. </li><li> Aquecer a solução a 55 ° C por 10 minutos (a solução ficará claro) e deixe esfriar até a temperatura ambiente antes da adição de 0,1% w / v BSA (albumina bovina), 10 mM CaCl 2 e 5 mM β-mercaptoetanol . </li></ol> 3) A colheita e protoplasting do material vegetal <ol><li> As raízes são colhidas por raspagem-los fora da tela de náilon com um bisturi e depositado em um frasco contendo a solução protoplasting. Geralmente, 10 ml de solução protoplasting é utilizado por 1.500 raízes das mudas. </li><li> Agitar o frasco suavemente (75 rpm) em temperatura ambiente por uma hora. Um maior tempo de incubação pode aumentar o rendimento de protoplastos, mas também irá adicionar ao efeito da protoplasting se na expressão do gene. </li><li> Filtrar a solução com um filtro de protoplastos de células 40 mM (BD Falcon) e dividir a solução sobre tubos de 15 ml cônico (BD Falcon). </li><li> Girar os tubos em uma centrífuga basculante para 10 minutos a 500 G. Observe que esta velocidade de centrifugação depende do tipo de protoplastos utilizados, a sua fragilidade e da quantidade de restos celulares produzidos durante o tratamento enzimático. </li><li> Remover a maior parte do sobrenadante, ressuspender o protoplastos na solução restante e inspecioná-los ao microscópio (Figura 3). </li><li> Fazer uso de um hemocitômetro para estimar o número e densidade de protoplastos. A densidade celular vai determinar a velocidade de injeção da amostra, os eventos por segunda taxa e, portanto, o tempo total necessário para classificar as células na FACS (ver também secção 4.3). </li><li> 3.7) Ou vá diretamente para FACS ou lavar e ressuspender o protoplastos em uma solução de incubação, como a W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, KCl 5 mM, 5 mM MES, pH ajustado para 5,7 com KOH) ou solução protoplasting sem a adicionado enzimas. Especialmente quando olhar para as mudanças de transcrição, é de importância para minimizar a exposição das amostras às condições que podem influenciar a expressão gênica, como alterar o buffer os protoplastos são mantidos dentro Portanto, é recomendável manter o protoplastos em solução e proceder protoplasting FACS para o mais rapidamente possível. </li></ol> 4) separação de células de fluorescência Activated de protoplastos <ol><li> Ligar e preparar o classificador de celular. Aqui, um FACSAria (BD) é usado. </li><li> Criar um fluxo de fluxo com 100 m &amp;u; m bico e uma pressão de 20 psi bainha. </li><li> A densidade de células ea velocidade de injeção de amostra pode ser ajustado para o experimento em particular com base em se um rendimento melhor ou maior velocidade alcançável é desejado. Temos classificadas com sucesso com densidades de até 10 milhões de células / ml. </li><li> Use a opção de agitação da amostra na FACS para evitar a sedimentação dos protoplastos. Se o entupimento da FACS é um problema, existem três etapas para solucionar problemas possíveis: 1. Executar uma amostra backflush-line. 2. Diluir sua suspensão de protoplastos para reduzir a densidade. 3. Limpar a solução de protoplastos, repetindo a etapa de filtração (3.3) após a centrifugação e ressuspensão. </li><li> Prepare o aparelho para medir a dispersão para a frente (FSC), dispersão lateral (SSC) e emissão a 530 / 30 nm para a GFP e 610/20 nm do espectro vermelho autofluorescência (RSA), após a excitação por um laser nm 488. Estes são em essência os únicos parâmetros utilizados para isolar a GFP positivas protoplastos. Aqui, as configurações de tensão foram os seguintes: FSC - 60V, SSC 250V, 350V e GFP RSA 335V. Observe que as configurações de tensão ideal será diferente para cada FACS e vai mesmo ter de ser ajustada ao longo de todo o ordenador de celular. </li><li> Começar pela criação de um dotplot para dispersão frontal versus dispersão lateral. Aplicar as configurações de tensão de forma que os eventos medidos estão centrados na trama. </li><li> Em seguida, crie um gráfico de pontos de verde contra vermelho sinais de fluorescência. Aplicar as configurações de tensão de forma que os eventos medidos produzir uma população centrada diagonal na trama quando se olha para uma suspensão de protoplastos do tipo selvagem (não-GFP). A suspensão de protoplastos derivados de uma linha de marcador GFP irá produzir uma população claras de verde fluorescente eventos nunca vistos em amostras do tipo selvagem. </li><li> Definir restrições de compensação para ajustar sobreposição espectral entre a GFP e RSA. Configurações restrição adequada compensação permitirá uma melhor separação dos protoplastos GFP-positivo do protoplastos não-GFP e detritos. As restrições usadas aqui são as seguintes: RSA, menos GFP 17,91%. </li><li> Configurar uma porta para identificar GFP-positivos eventos, um controle negativo de não-GFP protoplastos deve ser utilizada para auxiliar na definição dos limites do portão (Figura 4). </li><li> Implementar um corte de dispersão para a frente a fim de deixar pequenos detritos para fora da análise. Visualize os eventos GFP-positivo na trama FSC versus SSC para ajudar a determinar o posicionamento da corte. Aqui, o corte foi fixada em 5000. Note que o FACS contará detritos como ordenar os eventos e uma amostra com níveis elevados de detritos pode ter um por cento eventos diferentes GFP positivos que o esperado. Isso não é necessariamente um problema. No entanto, mais detritos na amostra, o mais longo do tipo vai demorar. </li><li> Dependendo da experiência e da abundância do tipo de célula a ser analisada, defina o modo de precisão FACS tanto para o rendimento ideal ou ótima pureza das células classificadas. </li><li> Para a extração de RNA, preparar tubos de coleta (tubos de 1,5 ml de microcentrífuga) com a quantidade adequada de RNA tampão de extração. Com esta configuração, 20.000 eventos de classificação vai render um volume total de aproximadamente 100 l, que foram classificados em até 350 mL de tampão de extração (RNeasy micro kit, QIAGEN). Mix amostras após a conclusão do tipo de suspensão de células pode piscina no topo. </li><li> Armazenar amostras ou ir diretamente para extração de RNA. Análises de microarranjos de sucesso foram pré-formados com o RNA extraído de tão pouco como 500 eventos classificados. Aqui, nós usamos um kit de extração RNeasy micro (QIAGEN), o WT-Ovation Pico sistema de amplificação de RNA e FL-Ovation cDNA Biotina Módulo V2 (NuGEN). </li></ol> Resultados representante Um phytatray de aproximadamente 1.500 de uma semana de idade SCR P:: mudas GFP rendeu cerca de 60.000 protoplastos (medida por hemocitômetro). 2,6% dos 65 mil eventos FACS-processados ​​foram definidos como sendo GFP-positivos e foram classificadas (Figura 4b). Oito placas de aproximadamente 1.500 de quatro dias de idade WOX5 P:: mudas GFP cada (12.000 total) rendeu cerca de 30 milhões de protoplastos (medida por hemocitômetro). 0,063% dos 16 milhões eventos FACS-processados ​​foram definidos como sendo GFP-positivos e foram classificadas (Figura 4c). 10.000 eventos classificados são normalmente utilizados para extração de RNA e pode render 20-140 ng total de RNA (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Tipo específico de células GFP linhas marcador na raiz Arabidopsis. Microscopia de fluorescência imagens foram tiradas com contraste de interferência diferencial (DIC) e um filtro de GFP em um microscópio Eclipse 90i (Nikon) rodando em software Metamorph (dispositivos Molecular). As imagens DIC e GFP foram sobrepostos para fins de visualização. As duas linhas de marcador usado neste experimento visuais são mostradas;a) P SCR:: GFP e b) P WOX5:: GFP. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Mudas de plantas condições de crescimento. Foram cultivadas em um controlador ambientais hydroponically em phytatrays (a) ou em placas de ágar posicionados verticalmente (b). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Protoplastos de plantas expressando GFP. Microscopia de fluorescência imagens foram tiradas com contraste de interferência diferencial (DIC) e um filtro de GFP em um microscópio Eclipse 90i (Nikon) rodando em software Metamorph (dispositivos Molecular). As imagens DIC e GFP foram sobrepostos para fins de visualização. Setas indicam uma célula estourar, restos celulares e um protoplastos GFP-positivo. A distância entre duas linhas brancas é 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Separação de células ativadas por fluorescência da GFP positivas protoplastos Protoplastos derivados de tipo selvagem (a) P SCR:.: GFP (b) ou P WOX5:: GFP (c) linhas marcador foram analisados ​​e classificados com uma FACSAria (BD) usando portas definidas em um dotplot de verde (530/30 nm; eixo x) versus vermelho (610/20 nm; eixo y) de fluorescência. 100 mil eventos são apresentados em cada parcela. Os eventos abrangidos pelo portão de separação GFP são destaque verde. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Representante RNA extrações de 10.000 células classificadas. As células foram classificadas diretamente para extração de RNA buffer (QIAGEN), o RNA foi purificado e sua pureza, concentração e integridade em um Bioanalyzer 2100 (Agilent). Três repetições para ambas as linhas marcador são mostrados.

<ol>
	<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127, 595-603 (2000).</li><li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots.">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li><li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity.">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).</li><li>Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+fluorescent+selection+permits+precise,+rapid,+and+in-depth+overexpression+analysis+in+plant+protoplasts.">Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts.</a> Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).</li><li>Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis.">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li></ol>

Protoplastos pode, em princípio, ser derivado de uma variedade de tecidos vegetais, otimizando as condições favoráveis ​​irá aumentar RNA qualidade e quantidade. Tanto a solução protoplasting eo buffer de incubação eletiva utilizado irá influenciar nesse aspecto. Muitos diferentes proteínas fluorescentes pode ser usada, dependendo das capacidades do FACS usado, por exemplo, GFP, RFP, YFP, PCP ou suas variantes muitos e derivados. A expressão dos marcadores pode ser c...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>250 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-250/50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-100/47</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-10k</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytatrays</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1552</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog Basal Medium (MS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S5-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M2933</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1767</td>
<td>10 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>Eclipse 90i microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-mannitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9546</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8041</td>
<td>1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CALBIOCHEM</td>
<td>444203</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2536</td>
<td> 1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>orbital shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LAB-LINE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>conical 15 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>table centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sorvall</td>
<td>Legend RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACSAria</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>20170-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy micro kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAGEN</td>
<td>74004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>WT-Ovation Pico RNA Amplification System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>3300_12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FL-Ovation cDNA Biotin Module V2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>4200_12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts

De alta resolução, tipo celular específico de análise da expressão do gene aumenta muito a compreensão da regulação do desenvolvimento e as respostas aos estímulos do ambiente em qualquer organismo multicelular. A hibridização in situ e visualização gene repórter pode até certo ponto ser utilizados para este fim, mas em alta resolução quantitativa RT-PCR ou high-throughput análise de transcriptoma-wide o isolamento de RNA a partir de tipos de células em particular é necessária. Dissociação do tecido celular expressando um marcador da proteína fluorescente em um tipo específico de célula e separação de células subseqüentes Fluorescence Activated (FACS) faz com que seja possível recolher uma quantidade suficiente de material para extração de RNA, análise, síntese / amplificação e microarray de cDNA. Um extenso conjunto de células de tipo específico linhas repórter fluorescente está disponível para a comunidade de pesquisa da planta. Neste caso, duas linhas marcador da raiz de Arabidopsis thaliana são usados: P SCR:: GFP (endoderme e centro quiescente) e P WOX5:: GFP (centro quiescente). Um grande número (milhares) de mudas são cultivadas em sistema hidropônico ou em placas de ágar e colhida para obter material suficiente raiz para análise posterior. Dissociação celular de material vegetal é obtido por digestão enzimática da parede celular. Este procedimento faz uso de plasmólise osmolaridade induzida por alta e celulases comercialmente disponíveis, pectinases e hemicelulases para liberar protoplastos em solução. FACS da GFP células positivas faz uso da visualização do verde contra o espectro de emissão vermelha de protoplastos animado por um laser nm 488. GFP-positivos protoplastos podem ser distinguidos pelo seu aumento da proporção de verde para emissão vermelha. Protoplastos são normalmente classificadas diretamente em tampão de extração de RNA e armazenados para posterior processamento em um momento posterior. Esta técnica é revelado para ser simples e viável. Além disso, é mostrado que ele pode ser usado sem dificuldades para isolar um número suficiente de células para análise de transcriptoma, mesmo para tipos de células muito escassos (por exemplo, células centro quiescente). Por último, uma instalação de crescimento para mudas de Arabidopsis é demonstrado que permite tratamento sem complicações da plantas, antes da separação de células (por exemplo, para o tipo específico de célula de análise de respostas de estresse bióticos ou abióticos). Suplementares potenciais usos para FACS de protoplastos de plantas são discutidos.

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Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Um método para isolar tipos específicos de células a partir de material vegetal é demonstrada. Esta técnica emprega linhas marcador transgênicos expressando proteínas fluorescentes em tipos de células particular, celular dissociação e classificação de fluorescência celular ativado. Além disso, uma instalação de crescimento é estabelecido aqui que facilita o tratamento de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Mudas antes da separação de células.

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.6K visualizações.  New York University. Um método para isolar tipos específicos de células a partir de material vegetal é demonstrada. Esta técnica emprega linhas marcador transgênicos expressando proteínas fluorescentes em tipos de células particular, celular dissociação e classificação de fluorescência celular ativado. Além disso, uma instalação de crescimento é estabelecido aqui que facilita o tratamento de Arabidopsis thaliana Mudas antes da separação de células.

Vídeo: Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biologia

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification of bacterial taxa that transform specific pools of DOC in nature poses a technical challenge. 
Here we describe an approach that couples bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, fluorescence activated cell sorting (FACS), and 16S rRNA gene-based molecular analysis that allows culture-independent identification of bacterioplankton capable of degrading a specific DOC compound in aquatic environments. Triplicate bacterioplankton microcosms are set up to receive both BrdU and a model DOC compound (DOC amendments), or only BrdU (no-addition control). BrdU substitutes the positions of thymidine in newly synthesized bacterial DNA and BrdU-labeled DNA can be readily immunodetected 1,2. Through a 24-hr incubation, bacterioplankton that are able to use the added DOC compound are expected to be selectively activated, and therefore have higher levels of BrdU incorporation (HI cells) than non-responsive cells in the DOC amendments and cells in no-addition controls (low BrdU incorporation cells, LI cells). After fluorescence immunodetection, HI cells are distinguished and physically separated from the LI cells by fluorescence activated cell sorting (FACS) 3. Sorted DOC-responsive cells (HI cells) are extracted for DNA and taxonomically identified through subsequent 16S rRNA gene-based analyses including PCR, clone library construction and sequencing.

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Environmental bacterioplankton are incubated with a model dissolved organic carbon (DOC) compound and a DNA labeling reagent, bromodeoxyuridine (BrdU). Afterward, DOC-degrading cells are separated from the bulk community based on their elevated BrdU incorporation using fluorescence activated cell sorting (FACS). These cells are then identified by subsequent molecular analyses.

Bromodeoxiuridina Labeling (BrdU) e separação de células subseqüentes Fluorescence Activated de Cultura independente de Identificação de carbono orgânico dissolvido de degradação bacterioplâncton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Microscopia de Luz Folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...