Financiamento fornecido pelo Arizona Sul Veterans Affairs Health Care Sistema VA Mérito comentário concessão 0142 e Biomédico de Investigação da Comissão conceder Arizona 0803.

Preparar tecidos para ser visualizado em slides <ol><li> A colonoscópio pode ser passado para o cólon através do reto. A colonoscópio é um tubo longo que tem iluminação e uma câmera de vídeo na cabeça, a capacidade de passar o ar para dentro do cólon para explodi-lo como um balão longo para permitir uma melhor visualização do cólon, e tem uma passagem para a pinça de biópsia que pode vão além da câmera de vídeo para beliscar fora de uma área de 3-5 milímetro da superfície interna &quot;pele&quot; ou camada mucosa do cólon para nos dar uma amostra da biópsia. A pinça de biópsia também pode ser usado para remover potencialmente pré-cancerosas pólipos encontrados no cólon. </li><li> Obtivemos biópsias de cólon normal de tecidos de mucosa de pacientes, com o consentimento informado. Esses pacientes foram submetidos a uma colonoscopia em uma clínica gastrointestinal. Nosso biópsias foram colocados em frascos de formol. Após 4 horas, o formol foi substituído por álcool 70%. </li><li> Amostras semelhantes de tecido foram retiradas de áreas de ressecções do cólon, removido durante a cirurgia, que foi de 1 cm e 10 cm de distância do câncer de cólon ou adenomas avançados com neoplasia. Estas amostras de tecido foram colocados em formol, e se as amostras de tecido foram grandes, alguns foram mantidos em formalina, por um longo período antes de serem colocados em álcool 70%. </li><li> As amostras de tecido são levados para um laboratório de histologia para ser processado e colocado em blocos de parafina. </li><li> Blocos de parafina são refrigerados no frigorífico para torná-los mais facilmente cortado por um micrótomo. </li><li> Cortes de tecido de 4 de espessura micron são cortados a partir dos blocos de tecidos, utilizando um micrótomo, e flutuou sobre a água. </li><li> Para comparar a expressão de duas proteínas, por exemplo ERCC1 e PMS2, cortes de tecido alternativo pode ser pego em dois slides, até há três cortes de tecido em cada uma das duas lâminas. Por exemplo, seções 1, 3 e 5 pode ser colocado em uma lâmina rotulados ERCC1 e seções 2, 4 e 6 pode ser colocado em uma lâmina rotulados PMS2. Com três cortes de tecido histoquímica para uma proteína em um único slide pode permitir que você veja se um padrão de coloração incomum de uma cripta é um artefato ou é real, já que os artefatos não seria repetido em mais de uma secção de tecido em um slide. Criptas do cólon são cerca de 60 mícrons de diâmetro, de modo que cerca de 15 secções de tecido pode ser cortado por meio de uma cripta, ea cripta mesmo poderia ser visto em várias secções de tecido por slide. </li></ol> Imunocoloração secções de tecido <ol><li> Os slides são então colocados através do procedimento de imunohistoquímica. Este é um procedimento de oito horas, e é bastante normal. As peças do procedimento que usamos, que não são normais, são o uso de recipientes Sequenza para a coloração, eo uso de uma solução para reduzir a coloração de fundo chamado de &quot;Sniper&quot;. O &quot;Sniper&quot; solução é vendida como uma fórmula patenteada pela Biocare Medical, Concord CA. </li><li> Alguns dos passos dos nossos procedimentos são mostrados aqui. </li><li> Como exemplo, para PMS2 imunohistoquímica, as lâminas são primeiro desparafinizadas colocando em 3 mudanças de xileno (3 minutos cada), seguidos por 2 mudanças em etanol 100% (2 minutos cada), seguidos por 2 mudanças em etanol 95% (2 minutos cada), seguidos de 2 mudanças de água destilada (2 minutos cada). Estes procedimentos são realizados sob um capuz químico com pressão negativa, para que o pesquisador não é exposto aos vapores. </li><li> Quando formol foi inicialmente utilizada para fixar o tecido, peças das proteínas na amostra de tecido tornou-se cross-linked. Agora, precisamos quebrar as ligações cruzadas de modo que um anticorpo capaz de reconhecer a proteína de interesse. Os slides são colocados em uma solução tampão que é trazido a uma fervura em forno de microondas. Isso é seguido por 10 minutos na configuração média, seguido de resfriamento por 20 minutos no gelo. Esta etapa precisa ser testado e ajustado para micro-ondas diferentes, até que bons resultados são alcançados. Note-se que para a imunocoloração CCOI ou Ku86 usamos um tampão citrato de sódio feito com ácido cítrico 9ml + citrato de sódio 41mL + 450ml H 2 O (incluindo um buffer de íons de sódio), que tinha um pH de cerca de 6.0, para ERCC1 usamos um tampão citrato feitas com ácido cítrico 2.1g + 1 litro H 2 O + ~ 5mL de hidróxido de sódio para trazer o pH para 6,1 (um buffer com o mínimo de íons de sódio adicionado), e para PMS2 usamos uma solução feita com uma solução de 5 mL Antígeno Unmasking (por VECTOR) + 533mL H 2 O. Buffers diferentes são necessários para aumentar a interação de anticorpos com epítopos de proteína particular. </li><li> Os slides são então colocados em peróxido de hidrogênio 3% (diluída em metanol) por 20 minutos seguido por uma lavagem em água destilada por 3 minutos, e lavadas em tampão fosfato (chamado PBS) por 5 minutos. </li><li> Slides são então colocados em flat racks coloração estreito chamado Sequenza (Shandon Sistema de imunocoloração Sequenza Thermo Scientific) e lavados com PBS. </li><li> Os slides sendo histoquímica para ERCC1 ou PMS2 são expostos então a 10 minutes exposição a um tratamento adicional de 3 gotas de uma solução proprietária, obtido a partir Biocare, chamado de &quot;Sniper&quot; que atua para reduzir a coloração não específica de proteínas de fundo. </li><li> Os slides são lavados com um buffer &quot;TBST&quot;, que é de 1 ml + 100 ml Tween 10x Tris + 900 ml de água destilada [onde Tris 10x é 24,2 gramas Trizma + 80 gramas NaCl + 1000 ml de água destilada e deionizada + HCl concentrado (cerca de 15 ml) para trazer a solução para pH 7,6]. </li><li> Slides são então lavadas três vezes com tampão, e 100 microlitros de DAKO anticorpo secundário biotinilado na diluição 1:100 (em 2% albumina bovina composta em tampão TBST) é adicionado aos slides e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Neste ponto, Vectastain ABC (Avidin Biotina Complexo) (a partir Vector Laboratories) reagente é preparado, usando 2,5 ml de PBS, uma solução de queda A, 1 B solução drop, ea solução é deixada em repouso por 30 minutos. </li><li> As lâminas são lavadas 3 vezes com tampão TBST. </li><li> Em seguida, 3 gotas de reagente Vectastain ABC é adicionado e as lâminas são incubadas em temperatura ambiente por 30 minutos, seguido de lavagem 2 vezes com TBST. </li><li> Slides são, então, imerso em DAB (diamino-benzamida) (2,9 ml DAB + 400 + 250 microlitros PBS o peróxido de hidrogênio microlitros) por cerca de 5 minutos. </li><li> Slides são então lavados duas vezes com água destilada deionizada. </li><li> Contracoloração é feito com uma solução diluída de hematoxilina por 10 segundos. Slides são lavados cuidadosamente em água da torneira, seguida de água deionizada. </li><li> Slides são então desidratado 2 vezes por 2 minutos em etanol 95%, 2 vezes por 2 minutos em etanol 100% e 2 vezes por 2 minutos em xileno. </li><li> Um par de gotas de Cytoseal XYL (Richard Allan-Científica) são então adicionados aos slides e uma lamela aplicada. </li><li> Avaliação imunohistoquímica de ERCC1, Ku86 e CCOI são realizadas usando o mesmo protocolo para PMS2, mas substituindo o anticorpo PMS2 com anticorpos para ERCC1, Ku86 e CCOI descritos na tabela abaixo. </li></ol> Avaliar cortes de tecidos para criptas deficiente na expressão de ERCC1, PMS2, Ku86 e CCOI <ol><li> Vamos primeiro olhar para cortes de tecidos sob um fotomicroscópio (DM-BA300) Motic à manifestação de PMS2 e ERCC1 em criptas da mucosa do cólon. </li><li> PMS2 e ERCC1 são enzimas de reparo de DNA, e assim eles estão localizados onde o DNA é, no núcleo das células das criptas. Isto é indicado na Figura 1, onde os dois pontos marrons representam coloração para ERCC1, ocorre no núcleo das células em uma cripta. A cripta normal, primeiro show no microscópio estava manchada de ERCC1, ea mancha marrom mostra a localização dos ERCC1. Destacam-se os tipos de células nas criptas, onde &quot;células caliciformes&quot; são forma semelhante a uma taça de vinho, com núcleos em uma pequena região na base das células na borda exterior da cripta, e um balão para fora seção, repletas de grânulos de mucina branco na parte da célula no interior da cripta. Os outros dois tipos de células olhar um pouco parecidos em nossos cortes corados, e eles são os enterócitos e células enteroendócrinas, e seus núcleos também estão na borda exterior da cripta, na base das células. Em biópsias de pacientes que nunca tiveram uma neoplasia do cólon, ou em biópsias longe de qualquer local do câncer de cólon, quase todos os núcleos em todas as criptas mostrar alto nível normal de expressão de ERCC1 como mostrado aqui. </li><li> Para orientar nossas observações, cortes de tecidos obtidos de biópsias de pacientes com neoplasia do cólon não são observados os níveis de expressão de PMS2, ERCC1, CCOI ou Ku86 na mucosa do cólon normal. Podemos observar todas as criptas em uma secção de tecido normal, com uma lente objetiva de 40x, como nós lentamente passar por uma secção de tecido inteiro e apontar as criptas, as células intersticiais, qualquer nódulos linfóides no slide, e os muscularis (se houver na biópsia). </li><li> Destacamos ainda, que há apenas várias células na base da cripta, que são as células-tronco. Essas células-tronco geram todos os cerca de 2.000 células da cripta completa. Uma célula-tronco com uma mutação ou um epimutation pode assumir o nicho inteiro com células-tronco. Em seguida, a cripta todo pode ter alterado a coloração de uma enzima de interesse (conversão crypt) como mostramos neste novo slide onde vemos criptas todo deficiente para CCOI ao lado de criptas que têm alta expressão de CCOI. </li><li> Então, vamos mostrar um slide de uma paciente com câncer de cólon ou um adenoma com neoplasia avançada. Neste slide, algumas criptas têm elevado nível normal de expressão para ERCC1 e alguns têm níveis mais baixos de expressão. Todas as criptas dentro da secção de tecido são fotografados em baixa resolução com uma lente objetiva de 10x, e as imagens são revestidas de modo que a secção de tecido inteiro é visto em uma imagem. As criptas são então numerados. </li><li> As criptas com alta expressão da enzima, típico de criptas em biópsias longe from qualquer tipo de câncer, são chamados de coloração nível &quot;4&quot;. Outros níveis são &quot;0&quot; se não existe uma expressão detectável, &quot;1&quot; se a expressão apenas mal detectável é evidente, &quot;2&quot; se houver um presente de expressão, mas a um nível muito mais baixo do que o nível 4, e &quot;3&quot; se a expressão é presentes em um nível inferior a 4, mas bastante forte. Nós dot cada slide sobre o azul de baixa resolução de imagem para quatro, laranja verde para 3, amarelo para 2, para 1 e vermelho para 0. Aqui nós mostramos passando por uma seção de uma biópsia usando uma lente objetiva de 40x. Nós dot criptas na imagem de baixa resolução. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A cripta do cólon mostrando alta expressão de ERCC1 nos núcleos das células da cripta. Todas as cores nesta imagem foram igualmente reforçada em contraste e saturação, usando o Paint Shop Pro 5. Resultados representante <ol><li> As secções de tecido alternativo em slides separados permitem-nos olhar para as criptas mesmo do cólon, com expressão de duas proteínas diferentes demonstrado por imunohistoquímica. A imagem de uma cripta para PMS2 manchado e manchado a cripta mesmo para ERCC1 é mostrado em microscópios adjacentes com monitores de computador adjacentes. Isso nos permite determinar se há carência conjunta de duas proteínas, ou se as deficiências em cada uma das proteínas, enquanto cada um é freqüente, ocorre de forma independente. Temos três cortes de tecido por lâmina, de modo que qualquer deficiência aparente na expressão de uma proteína pode ser verificado como sendo deficiente em mais de uma seção, e não devido a um artefato. Em tecidos circundantes cancros do cólon, onde há um defeito de campo que deu origem ao câncer, há uma alta freqüência de criptas deficiente para ERCC1 e PMS2. </li><li> Temos também utilizado imunohistoquímica para encontrar a frequência das criptas para deficientes Ku86 e CCOI. Neste slide, passamos por uma secção de tecido toda histoquímica para Ku86, usando uma lente objetiva de 40x, e podemos ver que algumas criptas são deficientes para Ku86 nesta seção tecido. </li><li> Da mesma forma, neste slide, passamos por uma secção de tecido toda histoquímica para CCOI, usando uma lente objetiva de 40x, e podemos ver que apenas um número moderado de criptas são deficientes para CCOI. </li></ol>

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<ol><li> É muito importante ter três cortes de tecido por slide. Bolhas pode ocorrer quando se aplica a mídia carregando o anticorpo, de modo que algumas criptas ou porções de criptas não pode ser manchada adequadamente só porque uma bolha impediu o anticorpo de reagir com a secção de tecido. Criptas são cerca de 60 mícrons de diâmetro, e secções de tecido são 4 mícrons de espessura, de modo que poderia haver até 15 cortes de tecidos através da cripta mesmo. Geralmente é possível encontrar a cripta mesmo, usando a morfologia da cripta como um guia, em cortes de tecidos múltiplos posicionados em um slide. </li><li> Em nossos estudos recentes, para amostras de tecido de grande porte, coloração em um Sequenza não pode dar cobertura de anticorpos bom para o tecido. Nestes casos, pode-se preferir usar mão coloração do tecido, onde uma gota de mídia contendo o anticorpo é mão colocada sobre cada amostra de tecido. </li><li> Para ver claramente a coloração marrom mostrando a expressão da proteína imunocoradas, ea coloração azul mostrando DNA nuclear no monitor do computador, o software fotomicroscópio Motic é ajustado como segue: Ganho 0, offset 0, Enhance 0, 255, Gamma 1,00, 0, nitidez 1, Correção de Cor 7, R, G, B Ganho 1,00, e R, G, B Brilho 0. A resolução é de 1024 x 768, e Balanço de Branco está ativado. </li><li> Nosso método pode ser usado com qualquer proteína que parecem ser importantes na progressão para o câncer de cólon, para avaliar a sua freqüência de deficiência, ou possivelmente superexpressão, nos defeitos de campo em torno cancros do cólon ou adenomas avançados com neoplasia. </li><li> Defeitos de campo são uma parte da progressão para o câncer A &quot;cancerização de campo&quot; termo foi usado pela primeira vez por Slaughter et al. Em 1953 para descrever uma área ou um &quot;campo&quot; do epitélio que tem sido pré-condicionado por processos em grande parte desconhecido (na época), de modo a predispô-lo para o desenvolvimento de câncer. O uso inicial foi no contexto de câncer oral. Desde então, os termos &quot;cancerização de campo&quot; e &quot;defeito no campo&quot; têm sido utilizados mais amplamente para descrever qualquer tecido pré-malignas em que novos cancros são mais susceptíveis de surgir, eo conceito de cancerização de campo na área da oncologia clínica tem recebido atenção crescente 2 . Recentemente, revisamos as evidências de defeitos de campo em câncer gastrointestinal 3. Incluídos nesta revisão foram os resultados de uma dezena de estudos comprovando os defeitos de campo no cólon. Defeitos de campo na mucosa do cólon, provavelmente, surgir por seleção natural de células mutantes ou células alteradas epigeneticamente entre as células-tronco de uma cripta de tal forma que uma célula-tronco sobrevive 4 sucessão de nicho. Instabilidade genética ou um fenótipo mutator, talvez devido à redução de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos ou de reparo do DNA mismatch, aceleraria esse processo (e um defeito freqüente em PMS2 foi relatado anteriormente em áreas circunvizinhas cancros do cólon 5). Se, em uma população normal de células-tronco na mucosa do cólon, uma célula adquire uma vantagem seletiva através de uma mutação ou uma epimutation, ele tenderá a expandir clonalmente à custa de células-tronco vizinhos. Na mucosa do cólon, o nicho de células-tronco é ocupada por ≤ 5 6 células que depois dão origem a todos (aproximadamente 2000), as células da cripta. A tomada de controlo do nicho de células-tronco por uma célula mutante ou resultados epigeneticamente alteradas digite &quot;conversão crypt&quot; 7. A disseminação de clones mutantes (criptas convertidos) no epitélio do cólon podem ocorrem mais freqüentemente por fissão cripta 8. Um exemplo de fissão cripta é mostrado na Figura 2. Desta forma, um pedaço de tecido anormal surge. Dentro como um remendo, uma segunda mutação tal pode ocorrer de forma que uma cripta dado adquire uma vantagem em comparação com outras criptas dentro do patch, e esta irá expandir cripta clonal formando uma mancha secundária dentro do patch original. Dentro desse novo patch, o processo pode ser repetido mais tempo de várias, talvez durante décadas, até que uma célula-tronco malignas que surge clonalmente expande para um câncer. Se este é o processo geral pelo qual adenocarcinomas do cólon esporádicos surgem, então adenocarcinomas do cólon geralmente deve ser associada, e ser precedido por, os campos de anormalidade. Assim, um pedaço de criptas convertido seria de esperar para ter defeitos perceptíveis na área em torno de um adenoma com neoplasia avançada, ou em torno de um câncer de cólon. A partir desse modelo de pré-tumor progressão, seria de esperar para encontrar alterações genéticas ou epigenéticas relacionadas à pré-tumor progressão entre amostras de tecido retiradas da mucosa não-neoplásica do cólon em áreas circunvizinhas lesões neoplásicas do cólon que são susceptíveis de evoluir para o câncer . Em particular, defeitos em enzimas de reparo de DNA, ou em proteínas necessárias para a apoptose, contribuiria para a progressão, aumentando a instabilidade genômica, e pode vir a ser encontrados em um campo com defeito. </li><li> Seleção para a deficiência na PMS2 quando as células são deficient para ERCC1 e submetido a um agente de danificar o DNA Nara et al. 9 cresceu 25 culturas de células de ovário de hamster chinês 43-3B, todos com uma mutação inativadora do gene de reparo do DNA ERCC1, e as culturas tratadas com um agente de danificar o DNA, MNNG. Entre as células sobreviventes ao tratamento de danos ao DNA, uma única célula foi isolado de cada cultura e permissão para formar um clone. Todos os clones foram isolados cerca de 10 vezes mais resistentes à morte por MNNG do que a cepa parental. Dos clones isolados, 22 foram provado ser defeituoso em reparo de DNA mismatch (MMR). Cinco destes 22 clones foram testados por seqüenciamento, e três dos cinco eram deficientes para PMS2. Esta seleção de defeito em PMS2 foi presumivelmente porque PMS2 deficiência causada resistência a apoptose e, portanto, capacidade de sobreviver a danos no DNA em células restantes adicionado quando ERCC1 estava ausente. (Normalmente, PMS2 sentidos níveis de dano de DNA, e faz com que as células em apoptose, quando o dano ao DNA é excessivo.) Assim, uma deficiência em PMS2 é selecionado para quando ERCC1 deficiente células estão sujeitas a danos no DNA. Clones defeituosos em ambos os ERCC1 e PMS2 foram mostrados para ter cerca de uma taxa de mutação 500-1000 vezes maior quando irradiada com UV do que as células dos pais. </li><li> Ácidos biliares causam estresse oxidativo, são agentes de danificar o DNA e são importantes para a progressão para o câncer de cólon Ácido deoxicólico, um ácido biliar, aumenta o estresse oxidativo através da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) por vários processos, incluindo danos de 10 mitocôndria. Há evidências recentes de que ROS causar alterações epigenéticas 11, e pelo menos 15 estudos têm mostrado que os ácidos biliares, aumento nas concentrações que acompanha uma dieta rica em gordura, causam danos ao DNA 12. Na revisão feita por Bernstein et al. 12, há uma associação positiva entre consumo de gordura na dieta ea incidência de câncer de cólon. Ácidos biliares são secretados no trato intestinal, em resposta a gordura na dieta e ácidos biliares atuam como detergentes para ajudar na digestão de gorduras. Assim, uma dieta rica em gordura está associada com aumento da secreção de ácidos biliares. Concentrações de ácido biliar fecal são elevados em populações com alta incidência de câncer de cólon e exposição excessiva aos ácidos biliares é considerado como um fator de risco para a carcinogênese de cólon 13. Ácidos biliares pode ser uma causa de defeitos de campo no cólon. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A fissão cripta do cólon em 3 criptas. Conclusão Encontramos uma alta freqüência de criptas deficientes em genes de reparo do DNA e ERCC1 PMS2 (PMS2 também é necessário para apoptose) em defeitos de campo grande em torno cancros do cólon. Deficiências no ERCC1 e PMS2 (devido a mudanças epigenéticas ou mutações) podem ser os primeiros passos na instabilidade genética fundamental para a progressão para o câncer de cólon.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

Na carcinogênese, o &quot;defeito de campo&quot; é reconhecida clinicamente por causa da alta propensão de sobreviventes de certos tipos de câncer de desenvolver outras doenças malignas do tipo de tecido mesmo, muitas vezes em um local nas proximidades. Defeitos de campo tenham sido indicados no câncer de cólon. As anormalidades moleculares que são responsáveis ​​por um defeito de campo no cólon deve ser detectável em alta freqüência no tecido histologicamente normal em torno de um adenocarcinoma do cólon ou em torno de um adenoma com neoplasia avançada (no bom caminho para um câncer de cólon), mas em baixa frequência na mucosa do cólon dos pacientes sem neoplasia do cólon. Usando imunohistoquímica, criptas todo dentro de 10 cm em cada lado do adenocarcinomas do cólon ou avançado neoplasias do cólon foram encontrados para ser freqüentemente reduzida ou ausente na expressão de duas proteínas de reparo do DNA, PMS2 e / ou ERCC1. PMS2 é uma proteína duplo papel ativo no reparo mismatch DNA, bem como necessários na apoptose de células com danos no DNA em excesso. ERCC1 está activo no reparo de DNA por excisão de nucleotídeos. A expressão reduzida ou ausente de ambos ERCC1 e PMS2 criaria células com maior capacidade tanto para sobreviver (resistência a apoptose) e aumento do nível de mutabilidade. A expressão reduzida ou ausente de ambos ERCC1 e PMS2 é provável um passo inicial na progressão para o câncer de cólon. DNA de genes de reparo Ku86 (ativo no DNA não-homólogos final juntar) e Citocromo Oxidase c Subunidade I (envolvidos na apoptose) cada um tinha sido relatada a ser diminuída na expressão em áreas da mucosa perto de câncer de cólon. No entanto, a avaliação imuno-histoquímica dos seus níveis de expressão mostrou apenas pouco a freqüências modesto de criptas a ser deficiente na sua expressão em um defeito de campo em torno do câncer de cólon ou ao redor neoplasia do cólon avançado. Mostramos, aqui, nosso método de avaliação das criptas para a expressão de ERCC1, PMS2, Ku86 e CCOI. Nós mostramos que a freqüência de criptas todo deficiente para PMS2 ERCC1 e muitas vezes é tão grande quanto 70% a 95% em 20 centímetros áreas em torno de um longo neoplasia do cólon, enquanto que a freqüência das criptas deficiente em Ku86 tem um valor médio de 2% e freqüência de criptas deficiente em CCOI tem um valor médio de 16% nessas áreas. Todo o cólon é de 150 cm de comprimento (cerca de 5 pés) e tem cerca de 10 milhões criptas em sua camada mucosa. O defeito no PMS2 e ERCC1 em torno de um câncer de cólon, assim, poderá incluir um milhão criptas. É a partir de uma cripta com defeito que surge o câncer de cólon.

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Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Expressão reduzida / ausente de PMS2 e / ou ERCC1 em criptas inteiro é um evento freqüente dentro de 10 centímetros em cada lado do adenocarcinomas do cólon, provavelmente a base de um defeito de campo com alta mutabilidade ea progressão para o câncer. Deficiência em Ku86 ou CCOI é muito menos freqüente nesses defeitos de campo.

PMS2 deficiente, ERCC1, Ku86, CCOI Defeitos em campo durante a progressão para cancro do cólon

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K visualizações.  University of Arizona, Tucson. Expressão reduzida / ausente de PMS2 e / ou ERCC1 em criptas inteiro é um evento freqüente dentro de 10 centímetros em cada lado do adenocarcinomas do cólon, provavelmente a base de um defeito de campo com alta mutabilidade ea progressão para o câncer. Deficiência em Ku86 ou CCOI é muito menos freqüente nesses defeitos de campo.

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Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Biologia

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Determinar a contribuição dos Sistemas de energia durante o exercício

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

O murino colina deficiente, Ethionine-completada (CDE) dieta modelo de lesão hepática crônica

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction defects can be assessed by tracking methylene blue dye flow within the urinary system. Methylene blue dye is injected into the renal pelvis of perinatal embryonic kidneys and dye flow is monitored from the renal pelvis of the kidney through the ureter and into the bladder lumen after applying hydrostatic pressure. Dye accumulation will be evident in the bladder lumen of the normal perinatal urinary tract, but will be constrained between the renal pelvis and the end point of an abnormal ureter, if urinary tract obstructions occur. This method facilitates the confirmation of urinary tract junction obstructions and visualization of hydronephrosis and hydroureter. This manuscript describes a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis to confirm urinary tract junction obstructions.

Methylene blue dye injection into the renal pelvis facilitates the assessment of urinary tract junction obstruction defects during mouse embryonic urinary tract development. Here, a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis is described.

Avaliar defeitos de obstrução do trato urinário junção por injeção de corante azul de metileno

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...