Os autores não têm confirmações.

Os procedimentos experimentais e tratamento ético dos animais foi aprovado pela Universidade de Pittsburgh IACUC (protocolo nº 1104674). 1. Preparação de G6PD Coloração Mistura NOTA: Certifique-se de que a concentração final de cada um dos reagentes é a seguinte; 5 mM de glicose-6-fosfato (G6P); NADP 2 mM, 5 mM de MgCl2, 0,35 mM de 1-metoxi-5-methylphenazinium sulfato de metilo (MMPMS) e 0,8 mM de NBT 1,8,9 Para cada reagente a concentração inicial foi derivado para um volume final de 40 ml.. As soluções foram preparados e utilizados a cada dia. <ol><li> Adicionar 2 ml de mM pH 7,4 tampão de fosfato 200 (PB) para 35 ml de meio de outubro em um tubo de 50 mL e agitar vigorosamente. Confirmar com papel de pH que a solução é ~ pH 7,4. Se não descartar a solução. </li><li> Adicionar 61 mg G6P dissolvido em 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg de NADP dissolvido em 0,94 ml de PB 200 mM, e 41 mg de MgCl2 dissolvido em 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmar que o pH é de ~ 7,4 sagacidadeh papel de pH. Se não ~ 7.4, rejeitar a solução. </li><li> Adicionam-se 5 mg de MMPMS dissolvidos em 0,25 ml de OP 200 mM (pH 7,4). Agitar vigorosamente a mistura de reacção resultante para gerar um homogeneizado claro vermelho escuro. Se a solução é turva, a mistura deve ser descartado. O tubo contendo a mistura reaccional é envolvido em folha para minimizar a exposição à luz. Armazenar a mistura de reacção à temperatura ambiente, enquanto o componente final, o NBT, é preparado. </li><li> Preparar separadamente uma solução de NBT 5 mM pela adição de 0,4 ml de dimetilformamida anidra (DMF) e 0,4 ml de etanol anidro a 164 mg de NBT em um tubo de 2 ml com uma tampa de O-ring. Fechar a tampa solta (não hermeticamente fechado) e levar a solução a ebulição vigorosa num banho de óleo até o NBT é em solução. 8 </li><li> Permitir que o NBT solubilizado a arrefecer até à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar toda a solução à mistura reaccional PTU e agitar vigorosamente para se obter uma solução clara. Observar a mudança de cor da solução de vermelho-alaranjado inicial a um vermelho-escuro ou purple cor ao longo do tempo. Isto é normal. </li><li> Coloque a mistura final coloração de G6PD num banho a 37 ° C sala quente durante 1 h antes da utilização. </li></ol> 2. Tratamento Animal e Recolha de Tecidos <ol><li> Tratar de 6 semanas de idade C57BL / 6, machos, com agente de danificação do ADN, por exemplo, 10 mg / kg de azoximetano (AOM), num volume de 200 ul de PBS por injecção ip. Tratar ratinhos de controlo com 200 mL de PBS por injecção ip. </li><li> Aos 90 dias, eutanásia ratos por asfixia com CO2 seguido por deslocamento cervical aprovado pelo protocolo IACUC. </li><li> Cirurgicamente abrir a cavidade abdominal, desde um pouco acima do ânus para a base do esterno. Mover o intestino delgado para fora da cavidade do corpo, mas que não excisar. Extirpar o intestino grosso, logo abaixo do ceco ao reto. 10 </li><li> Slice cuidadosamente ao longo de um lado do cólon usando uma tesoura de micro-dissecção e remover as fezes do cólon aberto limpo por lavagem com PBS estéril. Rocambole a impostos especiais de consumod colon com o lado luminal voltado para fora, e coloque em um molde de tecido 10. </li><li> Mergulhe completamente o cólon em outubro médio e lugar molde em uma Dewar contendo líquido N2. Segurar o molde de modo que a base de plástico é apenas em contacto com o líquido de N2 até a forma OCT é congelado. </li><li> Armazenar o bloco de tecido congelado a -80 até o corte cortes congelados. Não utilizar qualquer fixador, o que iria resultar na inactivação da enzima G6PD. </li></ol> 3. Preparação de secções congeladas <ol><li> Os cortes de tecido congelado com uma espessura de 7 uM utilizando um criostato a -25 ° C. Corte 4 consecutivos 7 mm seções e colocar dois deles na mesma lâmina (Figura 1). Preparar 2 corrediças, ou quatro secções consecutivas 7 uM para representar um nível do cólon (Figura 1). </li><li> Repita o procedimento para o próximo nível com uma distância mínima de&gt; 50 mm a partir da última seção do prnível evious. Esta distância assegurado que as criptas avaliada para cada nível não duplicar um ao outro. </li><li> Frequentemente limpar a lâmina de criostato com etanol a 100% para remover o resíduo OCT que se acumula durante o corte. Antes de seccionamento seja retomada, a lâmina seca é limpa com uma folha de secador antiestática para dissipar a carga estática acumulada. Loja slides com as secções congeladas a -80 o C. </li></ol> 4. Coloração de congelação do tecido <ol><li> Realizar a reação histoquímica da enzima em um 37 ° C sala quente com humidade elevada. NOTA: A tentativa da reação enzimática em um forno de incubação ou sobre um aquecedor de slides levou a coloração G6PD pobre e inconsistente. </li><li> Construção de poços para a coloração de tecidos usando dois 1,5 cm x 0,15 cm anilhas de aço (diâmetro interior x altura) que estão ligadas em conjunto com massa de silicone (Figura 1). Cortar o parafilme para encaixar a base do poço com o centro cortado e o bem lugard através da secção de tecido no slide. NOTA: O parafilme na parte inferior da máquina de lavar cria uma vedação entre a corrediça e a anilha que mantém a mistura de coloração de G6PD viscoso sobre a secção de tecido. Esta construção proporciona um poço com um 0,4 - 0,5 ml de volume de modo a que cada secção de tecido no estudo recebem o mesmo volume da mistura de reacção de coloração de G6PD. </li><li> Incubar as lâminas de tecido congelado a 37 o C em uma sala quente por 10 min. A 37 ° C, adiciona-se a mistura reaccional de coloração de G6PD a cada poço secção de tecido (2 secções por diapositivo) para 45-50 min. Remover as lâminas da sala quente, e retire cuidadosamente os poços de aço inoxidável fora dos slides. </li><li> Definir slides em sua borda longa para permitir que o meio de reação para drenar. Colocar as lâminas em PB 100 mM (pH 7,4) durante 30-60 minutos para remover a mistura de reacção de G6PD coloração do tecido, sem perturbar a coloração de tecidos. Mergulhe as lâminas em água destilada por 5-10 min para remover os sais PB </li><li> Selar o tecido por adding fluoro-gel a partir de um conta-gotas sobre o tecido e espera ~ 30 minutos para secar. Evitar bolhas que podem confundir a identificação de criptas mutados. NOTA: Se se formem bolhas, o procedimento pode ser repetido depois da remoção da f luoro-gel por imersão em água destilada. Não use lamelas como eles tendem a bolhas de ar armadilha. </li></ol> 5. Determinação da G6PD Mutant criptas e Mutação Freqüência <ol><li> Analisar escorregas para G6PD criptas mutantes sob um microscópio de luz. NOTA: Os critérios utilizados para identificar uma cripta totalmente mutante foram: (i) toda a cripta era desprovido de cor azul; (ii) a estrutura externa da cripta estava intacto, (iii) o mutante cripta foi observada em secções adjacentes 7 uM e, (iv) tinha dois observadores para identificar o mesmo cripta como um mutante. Mutantes observadas em adjacentes 7 mm seções são contados como um mutante. </li><li> Imagem cada cripta mutante G6PD em 40x e catalogar as imagens usando uma câmera de 5.0 megapixel comsoftware de imagem. </li><li> Quantificar o número total de criptas examinados num murganho, seleccionando uma secção representativa para cada rato a partir do nível com a área de superfície menor que a imagem e ampliação de 10x (Figura 1C). NOTA: A nível representa quatro consecutivos 7 mm seções (Figura 1D), que devido à sua proximidade muitas vezes mostram criptas mutantes em mais de uma seção. Os níveis são separados por&gt; 50 fim de visualizar a partir de diferentes áreas de criptas do cólon. </li><li> Abrir cada ficheiro de imagem visual e contagem do número de criptas em um nível através da análise dos arquivos (mostrados como caixas na Figura 1C). Arquivos de imagens irão variar no número de criptas observados a partir de tão baixo quanto 20 a&gt; 300 criptas em um arquivo. </li><li> Multiplicar o número total de criptas do nível seleccionado (Figura 1C) para cada rato ao número de níveis rastreados para criptas G6PD mutantes para cada um dos dois pontos. Por exemplo, uma contagem total de1.250 criptas por nível selecionado, multiplicado por 8 níveis selecionados para criptas mutantes é igual a uma contagem total de 10.000 criptas. Avaliar um mínimo de 10.000 criptas para cada cólon para análise estatística. </li><li> Combinar o número de mutantes observadas em todos os animais pelo número total de criptas rastreados para calcular o MF para cada tratamento. O nível MF células-tronco em ratos não tratados fundo é &lt;0.1x10 -4 (Tabela 1), que é próximo ao relatado anteriormente em camundongos C57BL / 6. 11 </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Muitas vezes a efeitos genotóxicos de um composto é determinada pela sua capacidade de modificar o ADN. Isso normalmente é feito pelo isolamento do tecido e medindo o nível global do adutos de DNA. Para AOM, isso envolveria quantificar O 6 -metilguanina adutos no cólon. Usando esta abordagem informações sobre os danos dentro tipos celulares específicos, tais como no nicho de células estaminais, é perdido. Além disso, um produto de adição de ADN não é o mesmo que uma mutação uma vez que apenas...

O cancro do cólon é pensado para envolver exposição a agentes ambientais e componentes da dieta que podem danificar DNA e produzir mutações ativadoras somáticas em oncogenes (por exemplo, ß-catenina) ou inativação de mutações em genes supressores de tumores (por exemplo, a APC). Supõe-se que estas mutações ocorrem em críticos células estaminais do cólon. Devido à arquitectura única cripta do epitélio do cólon, é possível medir as mutações de células estaminais no cólon após a exposição dos animais a produtos químicos associados com a carcinogénese do cólon. Várias enzimas ligadas ao cromossoma X pode servir como indicadores de mutações que ocorrem em células estaminais, como as mutações vão estar presentes em todas as células dentro de um cripta. Anteriormente, foi publicado um procedimento demonstrando que os produtos químicos que induzem tumores do cólon em ratos também gerado mutações somáticas de células estaminais no cólon através de análise de mutações em glicose-6-fosfato desidrogenase ligada ao cromossoma X do gene (G6PD) 1-3.O método quantifica a incidência de mutações somáticas aleatórios em células estaminais do cólon sem qualquer pressão selectiva. O procedimento envolve a produção de secções de cólon congelados não corrigidos de camundongos tratados e de controlo ea identificação das criptas desprovidas de células que produzem atividade G6PD funcional. Estes criptas mutadas, que aparecem branco, indicam que a mutação ocorreu em uma célula estaminal que deu origem a progénie também albergar um gene G6PD mutado. No ensaio enzimático, G6PD criptas mutante deficiente não pode oxidar a glicose-6-fosfato, o qual é necessário para a redução de nitro azul de tetrazólio (NBT). Quando a enzima é funcional em G6PD, o NBT na mistura corante é reduzida a formazano insolúvel e precipitados, acumulando no local da enzima e células &quot;azuis&quot; de coloração. As células que são mutantes G6PD permanecem esbranquiçada em contraste com corados com Azul criptas do tipo selvagem. Este método mede a mutações que têm um fenótipo &quot;nulo&quot;. Porque enZymes, tais como G6PD, pode difundir para fora das células sobre uma secção de tecido não fixado se as secções são colocadas numa solução aquosa, que é necessário para estabilizar a enzima nas secções de tecido a serem analisadas. 4 A estabilização da enzima na tecido não deve interferir com a difusão de moléculas pequenas de reagentes necessários para a reacção enzimática de G6PD. Fizemos uma série de mudanças significativas para o processo inicial. O meio para a coloração enzimática crítico foi alterado de álcool polivinílico óptima para o Composto Temperatura de corte (OCT), o que facilita o controlo do pH e a solubilização dos componentes utilizados no ensaio. A coloração é realizada usando 0,4 - 0,5 ml poços feitas de anilhas de aço de modo a que cada secção de tecido recebeu o mesmo volume da mistura de reacção de G6PD. Um procedimento foi desenvolvido para estimar o número de criptas em uma secção trabalhada que fornece uma grande amostragem de tecido do cólon sem terpara contar manualmente&gt; 10 5 para cada criptas do cólon. A análise de 7 uM secções de tecido adjacentes proporciona a visualização de uma cripta mutante em mais de uma corrediça, o que reduz os potenciais artefactos de coloração. Estas alterações tornam o procedimento mais eficiente e reprodutível. Usando este protocolo revisto, temos quantificada a frequência de mutação em células estaminais do cólon após a exposição de ratinhos C57BL / 6 para azoximetano, um carcinogéneo cólon bem conhecido em roedores. 5-7

<table><tbody><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nitroblue tetrazolium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glucose-6-phosphate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimethyl formamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffer (pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>warm room&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of  colonic stem cell mutations

A capacidade de medir mutações de células-tronco é uma ferramenta poderosa para quantificar em uma população de células crítico se, e em que medida, um produto químico pode induzir mutações que potencialmente levam ao câncer. O uso de um ensaio enzimático para a determinação de mutações de células estaminais no gene da desidrogenase de glicose-6-fosfato ligado ao X foi previamente relatada. 1 Este método requer a preparação de secções congeladas e incubação do tecido seccionado com uma mistura de reacção que produz um cor azul, se as células de produzir uma enzima funcional da desidrogenase glicose-6-fosfato (G6PD). Se não, as células parecem esbranquiçado. Modificou-se a mistura de reacção óptima utilizando o Composto Temperatura de corte (OCT) forma em lugar de álcool de polivinilo. Isto facilita a medição de pH, aumenta a solubilização dos componentes de coloração G6PD e restringe a difusão da enzima G6PD. Para demonstrar que a mutação ocorreu em uma célula estaminal, toda a cripta tem falta de G6PD enzimáticaactividade. Somente se uma célula-tronco abriga uma mutação G6PD fenotípica serão todos da descendência na cripta falta atividade enzimática da G6PD. Para identificar criptas com uma mutação de células-tronco, quatro cortes congelados adjacentes consecutivos (um nível) foram cortados em 7 mm espessura. Esta abordagem de fazer cortes adjacentes conformação que proporciona uma cripta foi completamente mutado desde o mesmo cripta mutado será observado nas secções adjacentes. As lâminas com amostras de tecido que eram mais do que 50 mm de intervalo, foram preparados para avaliar um total de&gt; 10 4 criptas por rato. A frequência de mutação é o número de mutantes (branco) criptas ÷ observados pelo número de tipo selvagem (azul) criptas em um grupo de tratamento.

A capacidade de medir mutações de células-tronco de cólon em animais oferece uma maneira única de correlacionar mutações para indução de cancro. Normalmente, presume-se que o passo crítico na carcinogénese envolve a activação de mutações em oncogenes e / ou inactivação de mutações em genes supressores de tumores. Nós injectados ratinhos C57BL / 6 com 200 ul de PBS ou 10 mg / kg OMA em 200 ul de PBS. OMA é uma substância cancerígena conhecida cólon. 5-7 Aos 90 dias os dois pontos foram ...

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Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K visualizações.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

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Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Pesquisa do câncer

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification1.
A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).
The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types2,3. However, no single &#x2018;marker&#x2019; has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. 
A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple 'markers'. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. 
In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response5, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody6. 
For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells7. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.

We described a procedure for the disaggregation of colorectal cancer (CRC) to produce viable single cells, which are then captured on customized antibody microarrays recognizing surface antigens (DotScan CRC microarray). Sub-populations of cells bound to the microarray can be profiled by fluorescence multiplexing using monoclonal antibodies tagged with fluorescent dyes.

Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Imunologia e Infecção

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the initiation of cancer stemness properties. Since gene expression in the formation of colorectal cancer-derived tumorspheres is unclear, it takes time to discover the mechanisms working on one gene at a time. This study demonstrates a method to quickly discover the driver genes involved in the survival of the colorectal cancer stem-like cells in vitro. Colorectal HT29 cancer cells that express the LGR5 when cultured as spheroids and accompany an increase CD133 stemness markers were selected and used in this study. The protocol presented is used to perform RNAseq with available bioinformatics to quickly uncover the overexpressed driver genes in the formation of colorectal HT29-derived stem-like tumorspheres. The methodology can quickly screen and discover potential driver genes in other disease models.

Presented here is a protocol to discover the overexpressed driver genes maintaining the established cancer stem-like cells derived from colorectal HT29 cells. RNAseq with available bioinformatics was performed to investigate and screen gene expression networks for elucidating a potential mechanism involved in the survival of targeted tumor cells.

Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for tumor development, maintenance, and resistance to drugs. A better understanding of CSC properties for their specific targeting is, therefore, a pre-requisite for effective therapy. However, there is a paucity of suitable preclinical models for in-depth investigations. Although in vitro two-dimensional (2D) cancer cell lines provide valuable insights into tumor biology, they do not replicate the phenotypic and genetic tumor heterogeneity. In contrast, three-dimensional (3D) models address and reproduce near-physiological cancer complexity and cell heterogeneity. The aim of this work was to design a robust and reproducible 3D culture system to study CSC biology. The present methodology describes the development and optimization of conditions to generate 3D spheroids, which are homogenous in size, from Caco2 colon adenocarcinoma cells, a model that can be used for long-term culture. Importantly, within the spheroids, the cells which were organized around lumen-like structures, were characterized by differential cell proliferation patterns and by the presence of CSCs expressing a panel of markers. These results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this 3D approach to study cell heterogeneity and CSC biology, including the response to chemotherapy.

This protocol presents a novel, robust, and reproducible culture system to generate and grow three-dimensional spheroids from Caco2 colon adenocarcinoma cells. The results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this approach to study cancer stem cell biology, including the response to chemotherapy.

Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

Análise comparativa de lesões por meio de uma abordagem de sequenciamento direcionada

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Comportamento

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Os fibroblastos

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Medicina

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other malignancies of the same tissue type, often in a nearby location. Such field defects have been indicated in colon cancer. The molecular abnormalities that are responsible for a field defect in the colon should be detectable at high frequency in the histologically normal tissue surrounding a colonic adenocarcinoma or surrounding an adenoma with advanced neoplasia (well on the way to a colon cancer), but at low frequency in the colonic mucosa from patients without colonic neoplasia.
Using immunohistochemistry, entire crypts within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas or advanced colonic neoplasias were found to be frequently reduced or absent in expression for two DNA repair proteins, Pms2 and/or ERCC1. Pms2 is a dual role protein, active in DNA mismatch repair as well as needed in apoptosis of cells with excess DNA damage. ERCC1 is active in DNA nucleotide excision repair. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 would create cells with both increased ability to survive (apoptosis resistance) and increased level of mutability. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 is likely an early step in progression to colon cancer.
DNA repair gene Ku86 (active in DNA non-homologous end joining) and Cytochrome c Oxidase Subunit I (involved in apoptosis) had each been reported to be decreased in expression in mucosal areas close to colon cancers. However, immunohistochemical evaluation of their levels of expression showed only low to modest frequencies of crypts to be deficient in their expression in a field defect surrounding colon cancer or surrounding advanced colonic neoplasia.
We show, here, our method of evaluation of crypts for expression of ERCC1, Pms2, Ku86 and CcOI. We show that frequency of entire crypts deficient for Pms2 and ERCC1 is often as great as 70% to 95% in 20 cm long areas surrounding a colonic neoplasia, while frequency of crypts deficient in Ku86 has a median value of 2% and frequency of crypts deficient in CcOI has a median value of 16% in these areas. The entire colon is 150 cm long (about 5 feet) and has about 10 million crypts in its mucosal layer. The defect in Pms2 and ERCC1 surrounding a colon cancer thus may include 1 million crypts. It is from a defective crypt that colon cancer arises.

Reduced/absent expression of Pms2 and/or ERCC1 in entire crypts is a frequent event within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas, likely the basis of a field defect with high mutability and progression to cancer. Deficiency in Ku86 or CcOI is much less frequent in these field defects.

PMS2 deficiente, ERCC1, Ku86, CCOI Defeitos em campo durante a progressão para cancro do cólon

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

Biologia

MLH1 Gene Expression in Peripheral Blood in Colon Cancer Patients and Their Association with Colon Cancer

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops caused by nucleotide misincorporation. In the absence of MLH1 protein, the frequency of non-repaired mismatches increases, resulting in organ cancer. The current study sought to quantify MLH1 gene expression and its relationship with tumor invasion (T) and lymph node invasion (N) in blood samples from patients with colorectal cancer (CRC). Blood samples were obtained from 36 CRC patients. RNA was extracted, and cDNA was synthesized using a kit. The primers were built using the exon-exon junction approach, and MLH1 and &#946;-actin genes were tested 3x using real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR). Gene expression analysis software was used to analyze the data, and a t-test was used to examine the expression of MLH1 and its connection with T and N variables. In this study, 36 patients with colorectal cancer, including 15 (41.6%) women and 21 (58.4%) men, with a mean age of 57.35 &plusmn; 4.22 years and in the age range of 26-87 years, were included. The results showed that the ratio of MLH1 gene expression in patients decreased compared to that in healthy individuals, and the decrease in gene expression at different stages of the disease was significant. The results of this study showed that the reduction of MLH1 gene expression has an effective role in the development of CRC.

This study examines the association between MLH1 gene expression in peripheral blood and colon cancer, utilizing a case-control approach to compare expression levels in patients and matched healthy controls.

MLH1 Expressão gênica no sangue periférico em pacientes com câncer de cólon e sua associação com câncer de cólon

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops ...