Os autores não têm confirmações.

Os procedimentos experimentais e tratamento ético dos animais foi aprovado pela Universidade de Pittsburgh IACUC (protocolo nº 1104674). 1. Preparação de G6PD Coloração Mistura NOTA: Certifique-se de que a concentração final de cada um dos reagentes é a seguinte; 5 mM de glicose-6-fosfato (G6P); NADP 2 mM, 5 mM de MgCl2, 0,35 mM de 1-metoxi-5-methylphenazinium sulfato de metilo (MMPMS) e 0,8 mM de NBT 1,8,9 Para cada reagente a concentração inicial foi derivado para um volume final de 40 ml.. As soluções foram preparados e utilizados a cada dia. <ol><li> Adicionar 2 ml de mM pH 7,4 tampão de fosfato 200 (PB) para 35 ml de meio de outubro em um tubo de 50 mL e agitar vigorosamente. Confirmar com papel de pH que a solução é ~ pH 7,4. Se não descartar a solução. </li><li> Adicionar 61 mg G6P dissolvido em 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg de NADP dissolvido em 0,94 ml de PB 200 mM, e 41 mg de MgCl2 dissolvido em 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmar que o pH é de ~ 7,4 sagacidadeh papel de pH. Se não ~ 7.4, rejeitar a solução. </li><li> Adicionam-se 5 mg de MMPMS dissolvidos em 0,25 ml de OP 200 mM (pH 7,4). Agitar vigorosamente a mistura de reacção resultante para gerar um homogeneizado claro vermelho escuro. Se a solução é turva, a mistura deve ser descartado. O tubo contendo a mistura reaccional é envolvido em folha para minimizar a exposição à luz. Armazenar a mistura de reacção à temperatura ambiente, enquanto o componente final, o NBT, é preparado. </li><li> Preparar separadamente uma solução de NBT 5 mM pela adição de 0,4 ml de dimetilformamida anidra (DMF) e 0,4 ml de etanol anidro a 164 mg de NBT em um tubo de 2 ml com uma tampa de O-ring. Fechar a tampa solta (não hermeticamente fechado) e levar a solução a ebulição vigorosa num banho de óleo até o NBT é em solução. 8 </li><li> Permitir que o NBT solubilizado a arrefecer até à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar toda a solução à mistura reaccional PTU e agitar vigorosamente para se obter uma solução clara. Observar a mudança de cor da solução de vermelho-alaranjado inicial a um vermelho-escuro ou purple cor ao longo do tempo. Isto é normal. </li><li> Coloque a mistura final coloração de G6PD num banho a 37 ° C sala quente durante 1 h antes da utilização. </li></ol> 2. Tratamento Animal e Recolha de Tecidos <ol><li> Tratar de 6 semanas de idade C57BL / 6, machos, com agente de danificação do ADN, por exemplo, 10 mg / kg de azoximetano (AOM), num volume de 200 ul de PBS por injecção ip. Tratar ratinhos de controlo com 200 mL de PBS por injecção ip. </li><li> Aos 90 dias, eutanásia ratos por asfixia com CO2 seguido por deslocamento cervical aprovado pelo protocolo IACUC. </li><li> Cirurgicamente abrir a cavidade abdominal, desde um pouco acima do ânus para a base do esterno. Mover o intestino delgado para fora da cavidade do corpo, mas que não excisar. Extirpar o intestino grosso, logo abaixo do ceco ao reto. 10 </li><li> Slice cuidadosamente ao longo de um lado do cólon usando uma tesoura de micro-dissecção e remover as fezes do cólon aberto limpo por lavagem com PBS estéril. Rocambole a impostos especiais de consumod colon com o lado luminal voltado para fora, e coloque em um molde de tecido 10. </li><li> Mergulhe completamente o cólon em outubro médio e lugar molde em uma Dewar contendo líquido N2. Segurar o molde de modo que a base de plástico é apenas em contacto com o líquido de N2 até a forma OCT é congelado. </li><li> Armazenar o bloco de tecido congelado a -80 até o corte cortes congelados. Não utilizar qualquer fixador, o que iria resultar na inactivação da enzima G6PD. </li></ol> 3. Preparação de secções congeladas <ol><li> Os cortes de tecido congelado com uma espessura de 7 uM utilizando um criostato a -25 ° C. Corte 4 consecutivos 7 mm seções e colocar dois deles na mesma lâmina (Figura 1). Preparar 2 corrediças, ou quatro secções consecutivas 7 uM para representar um nível do cólon (Figura 1). </li><li> Repita o procedimento para o próximo nível com uma distância mínima de&gt; 50 mm a partir da última seção do prnível evious. Esta distância assegurado que as criptas avaliada para cada nível não duplicar um ao outro. </li><li> Frequentemente limpar a lâmina de criostato com etanol a 100% para remover o resíduo OCT que se acumula durante o corte. Antes de seccionamento seja retomada, a lâmina seca é limpa com uma folha de secador antiestática para dissipar a carga estática acumulada. Loja slides com as secções congeladas a -80 o C. </li></ol> 4. Coloração de congelação do tecido <ol><li> Realizar a reação histoquímica da enzima em um 37 ° C sala quente com humidade elevada. NOTA: A tentativa da reação enzimática em um forno de incubação ou sobre um aquecedor de slides levou a coloração G6PD pobre e inconsistente. </li><li> Construção de poços para a coloração de tecidos usando dois 1,5 cm x 0,15 cm anilhas de aço (diâmetro interior x altura) que estão ligadas em conjunto com massa de silicone (Figura 1). Cortar o parafilme para encaixar a base do poço com o centro cortado e o bem lugard através da secção de tecido no slide. NOTA: O parafilme na parte inferior da máquina de lavar cria uma vedação entre a corrediça e a anilha que mantém a mistura de coloração de G6PD viscoso sobre a secção de tecido. Esta construção proporciona um poço com um 0,4 - 0,5 ml de volume de modo a que cada secção de tecido no estudo recebem o mesmo volume da mistura de reacção de coloração de G6PD. </li><li> Incubar as lâminas de tecido congelado a 37 o C em uma sala quente por 10 min. A 37 ° C, adiciona-se a mistura reaccional de coloração de G6PD a cada poço secção de tecido (2 secções por diapositivo) para 45-50 min. Remover as lâminas da sala quente, e retire cuidadosamente os poços de aço inoxidável fora dos slides. </li><li> Definir slides em sua borda longa para permitir que o meio de reação para drenar. Colocar as lâminas em PB 100 mM (pH 7,4) durante 30-60 minutos para remover a mistura de reacção de G6PD coloração do tecido, sem perturbar a coloração de tecidos. Mergulhe as lâminas em água destilada por 5-10 min para remover os sais PB </li><li> Selar o tecido por adding fluoro-gel a partir de um conta-gotas sobre o tecido e espera ~ 30 minutos para secar. Evitar bolhas que podem confundir a identificação de criptas mutados. NOTA: Se se formem bolhas, o procedimento pode ser repetido depois da remoção da f luoro-gel por imersão em água destilada. Não use lamelas como eles tendem a bolhas de ar armadilha. </li></ol> 5. Determinação da G6PD Mutant criptas e Mutação Freqüência <ol><li> Analisar escorregas para G6PD criptas mutantes sob um microscópio de luz. NOTA: Os critérios utilizados para identificar uma cripta totalmente mutante foram: (i) toda a cripta era desprovido de cor azul; (ii) a estrutura externa da cripta estava intacto, (iii) o mutante cripta foi observada em secções adjacentes 7 uM e, (iv) tinha dois observadores para identificar o mesmo cripta como um mutante. Mutantes observadas em adjacentes 7 mm seções são contados como um mutante. </li><li> Imagem cada cripta mutante G6PD em 40x e catalogar as imagens usando uma câmera de 5.0 megapixel comsoftware de imagem. </li><li> Quantificar o número total de criptas examinados num murganho, seleccionando uma secção representativa para cada rato a partir do nível com a área de superfície menor que a imagem e ampliação de 10x (Figura 1C). NOTA: A nível representa quatro consecutivos 7 mm seções (Figura 1D), que devido à sua proximidade muitas vezes mostram criptas mutantes em mais de uma seção. Os níveis são separados por&gt; 50 fim de visualizar a partir de diferentes áreas de criptas do cólon. </li><li> Abrir cada ficheiro de imagem visual e contagem do número de criptas em um nível através da análise dos arquivos (mostrados como caixas na Figura 1C). Arquivos de imagens irão variar no número de criptas observados a partir de tão baixo quanto 20 a&gt; 300 criptas em um arquivo. </li><li> Multiplicar o número total de criptas do nível seleccionado (Figura 1C) para cada rato ao número de níveis rastreados para criptas G6PD mutantes para cada um dos dois pontos. Por exemplo, uma contagem total de1.250 criptas por nível selecionado, multiplicado por 8 níveis selecionados para criptas mutantes é igual a uma contagem total de 10.000 criptas. Avaliar um mínimo de 10.000 criptas para cada cólon para análise estatística. </li><li> Combinar o número de mutantes observadas em todos os animais pelo número total de criptas rastreados para calcular o MF para cada tratamento. O nível MF células-tronco em ratos não tratados fundo é &lt;0.1x10 -4 (Tabela 1), que é próximo ao relatado anteriormente em camundongos C57BL / 6. 11 </li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li><li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells.">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Muitas vezes a efeitos genotóxicos de um composto é determinada pela sua capacidade de modificar o ADN. Isso normalmente é feito pelo isolamento do tecido e medindo o nível global do adutos de DNA. Para AOM, isso envolveria quantificar O 6 -metilguanina adutos no cólon. Usando esta abordagem informações sobre os danos dentro tipos celulares específicos, tais como no nicho de células estaminais, é perdido. Além disso, um produto de adição de ADN não é o mesmo que uma mutação uma vez que apenas...

O cancro do cólon é pensado para envolver exposição a agentes ambientais e componentes da dieta que podem danificar DNA e produzir mutações ativadoras somáticas em oncogenes (por exemplo, ß-catenina) ou inativação de mutações em genes supressores de tumores (por exemplo, a APC). Supõe-se que estas mutações ocorrem em críticos células estaminais do cólon. Devido à arquitectura única cripta do epitélio do cólon, é possível medir as mutações de células estaminais no cólon após a exposição dos animais a produtos químicos associados com a carcinogénese do cólon. Várias enzimas ligadas ao cromossoma X pode servir como indicadores de mutações que ocorrem em células estaminais, como as mutações vão estar presentes em todas as células dentro de um cripta. Anteriormente, foi publicado um procedimento demonstrando que os produtos químicos que induzem tumores do cólon em ratos também gerado mutações somáticas de células estaminais no cólon através de análise de mutações em glicose-6-fosfato desidrogenase ligada ao cromossoma X do gene (G6PD) 1-3.O método quantifica a incidência de mutações somáticas aleatórios em células estaminais do cólon sem qualquer pressão selectiva. O procedimento envolve a produção de secções de cólon congelados não corrigidos de camundongos tratados e de controlo ea identificação das criptas desprovidas de células que produzem atividade G6PD funcional. Estes criptas mutadas, que aparecem branco, indicam que a mutação ocorreu em uma célula estaminal que deu origem a progénie também albergar um gene G6PD mutado. No ensaio enzimático, G6PD criptas mutante deficiente não pode oxidar a glicose-6-fosfato, o qual é necessário para a redução de nitro azul de tetrazólio (NBT). Quando a enzima é funcional em G6PD, o NBT na mistura corante é reduzida a formazano insolúvel e precipitados, acumulando no local da enzima e células &quot;azuis&quot; de coloração. As células que são mutantes G6PD permanecem esbranquiçada em contraste com corados com Azul criptas do tipo selvagem. Este método mede a mutações que têm um fenótipo &quot;nulo&quot;. Porque enZymes, tais como G6PD, pode difundir para fora das células sobre uma secção de tecido não fixado se as secções são colocadas numa solução aquosa, que é necessário para estabilizar a enzima nas secções de tecido a serem analisadas. 4 A estabilização da enzima na tecido não deve interferir com a difusão de moléculas pequenas de reagentes necessários para a reacção enzimática de G6PD. Fizemos uma série de mudanças significativas para o processo inicial. O meio para a coloração enzimática crítico foi alterado de álcool polivinílico óptima para o Composto Temperatura de corte (OCT), o que facilita o controlo do pH e a solubilização dos componentes utilizados no ensaio. A coloração é realizada usando 0,4 - 0,5 ml poços feitas de anilhas de aço de modo a que cada secção de tecido recebeu o mesmo volume da mistura de reacção de G6PD. Um procedimento foi desenvolvido para estimar o número de criptas em uma secção trabalhada que fornece uma grande amostragem de tecido do cólon sem terpara contar manualmente&gt; 10 5 para cada criptas do cólon. A análise de 7 uM secções de tecido adjacentes proporciona a visualização de uma cripta mutante em mais de uma corrediça, o que reduz os potenciais artefactos de coloração. Estas alterações tornam o procedimento mais eficiente e reprodutível. Usando este protocolo revisto, temos quantificada a frequência de mutação em células estaminais do cólon após a exposição de ratinhos C57BL / 6 para azoximetano, um carcinogéneo cólon bem conhecido em roedores. 5-7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitroblue tetrazolium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose-6-phosphate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm room&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of  colonic stem cell mutations

A capacidade de medir mutações de células-tronco é uma ferramenta poderosa para quantificar em uma população de células crítico se, e em que medida, um produto químico pode induzir mutações que potencialmente levam ao câncer. O uso de um ensaio enzimático para a determinação de mutações de células estaminais no gene da desidrogenase de glicose-6-fosfato ligado ao X foi previamente relatada. 1 Este método requer a preparação de secções congeladas e incubação do tecido seccionado com uma mistura de reacção que produz um cor azul, se as células de produzir uma enzima funcional da desidrogenase glicose-6-fosfato (G6PD). Se não, as células parecem esbranquiçado. Modificou-se a mistura de reacção óptima utilizando o Composto Temperatura de corte (OCT) forma em lugar de álcool de polivinilo. Isto facilita a medição de pH, aumenta a solubilização dos componentes de coloração G6PD e restringe a difusão da enzima G6PD. Para demonstrar que a mutação ocorreu em uma célula estaminal, toda a cripta tem falta de G6PD enzimáticaactividade. Somente se uma célula-tronco abriga uma mutação G6PD fenotípica serão todos da descendência na cripta falta atividade enzimática da G6PD. Para identificar criptas com uma mutação de células-tronco, quatro cortes congelados adjacentes consecutivos (um nível) foram cortados em 7 mm espessura. Esta abordagem de fazer cortes adjacentes conformação que proporciona uma cripta foi completamente mutado desde o mesmo cripta mutado será observado nas secções adjacentes. As lâminas com amostras de tecido que eram mais do que 50 mm de intervalo, foram preparados para avaliar um total de&gt; 10 4 criptas por rato. A frequência de mutação é o número de mutantes (branco) criptas ÷ observados pelo número de tipo selvagem (azul) criptas em um grupo de tratamento.

A capacidade de medir mutações de células-tronco de cólon em animais oferece uma maneira única de correlacionar mutações para indução de cancro. Normalmente, presume-se que o passo crítico na carcinogénese envolve a activação de mutações em oncogenes e / ou inactivação de mutações em genes supressores de tumores. Nós injectados ratinhos C57BL / 6 com 200 ul de PBS ou 10 mg / kg OMA em 200 ul de PBS. OMA é uma substância cancerígena conhecida cólon. 5-7 Aos 90 dias os dois pontos foram ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations at JoVE.com

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.5K visualizações.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Vídeo: Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

Geração de Murino Marcapasso Cardíaco Agregados célula com base na ES-Cell-Programação em combinação com Myh6-Promotor-Seleção

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Biologia do Desenvolvimento

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

Protocolos para analisar o papel das células Paneth em Regenerar o Intestino Murino utilizando Condicional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Ordenação temporal de Expressão Dynamic Data de expressão espacial mapas detalhados

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...