Nosso protocolo utilizou RNA-Seq e ferramentas bioinformaticas para descobrir rapidamente os genes de driver superexpressos que contribuem para a formação de tumores colorretais semelhantes a troncos. Este protocolo é usado para rastrear um gene expresso diferencialmente e caminhos de sinal para investigar um mecanismo molecular para a stemness do câncer em um câncer colorretal seletivo. No sétimo dia de cultura, use um microscópio invertido com um sistema de imagem celular digital para observar e medir o diâmetro dos tumores.
Quando os tumores atingirem um diâmetro maior que 100 micrômetros, trate a cultura com 0,25% de trippsina. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, neutralize o trippsin com duas vezes o volume do meio de crescimento e conte as células usando um hemócito. Recolher as células por centrifugação.
E resuspenja a pelota em cinco vezes 10 para as quatro células por 100 microliters de concentração média. Adicione dois microliters do anticorpo primário de interesse a cada tubo e incuba as células por 30 minutos à temperatura ambiente e 200 revoluções por minuto. Ao final da incubação, lave cada tubo com 900 microlitadores de PBS e analise as células para expressão da proteína de interesse por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão.
Para o isolamento do RNA após a coleta de trippsina como apenas demonstrado, resuspenque as células em duas vezes 10 a 5 células por 50 microliters de concentração de PBS elise cada amostra com 200 microliters de tampão de lise suplementados com dois microliters de beta mercaptoetanol por tubo. Após um breve vórtice e uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, colete os lises por centrifugação e adicione 200 microliters de 70% de etanol a cada tubo. Transfira as amostras para colunas rápidas e remova o solvente por centrifugação.
Lave as amostras com 400 microlitadores de solução de lavagem uma e 600 microliters de solução de lavagem dois para remover completamente qualquer não-RNA por centrifugação, seguido por uma centrífuga adicional de dois minutos sob as mesmas condições centrífugas para remover qualquer etanol residual. Em seguida, resuspengue as pelotas em 50 microliters de água destilada por tubo e centrifugar a amostra por um minuto antes de coletar o RNA contendo supernantes. Para investigar a expressão genética diferencial entre as células tumorais em comparação com as células tumorais parentais após a análise de sequenciamento de RNA.
Selecione genes com uma alteração maior que um a menos um log2 fold com contagem de leitura superior a 100 na tumorfera e grupos parentais. E use os comandos como indicado. Para obter um gráfico vulcâneo dos dados para determinar a expressão genética diferencial.
Para a seleção de genes de unidade no analista de rede, selecione entrada de genes únicos e copie e cole os genes superexpressos selecionados com o humano especificado como o organismo e o símbolo genético oficial como o tipo de ID. Clique em Carregar e proceda. Para inserir e analisar os dados usando interação proteína-proteína, seguindo a interação genética proteína-proteína, use o banco de dados string interactome com um escore de confiança cortado de 900 para mostrar os genes das sementes.
Cruzando os genes carregados. Os genes de sementes que se associam a mais genes individuais podem ser selecionados como genes condutores que podem estar envolvidos na manutenção da formação da tumorfera. Selecione Prosseguir na visão geral do mapeamento em branco no Atlas de Fundo e Força no botão Layout.
Em seguida, selecione o par base PANTHER para analisar o grupo genético de regulação. Tumores de maiores de 100 micrômetros de diâmetro se formam dentro de sete dias de cultura. A análise citométrica do fluxo revela um aumento na expressão LGR5 e CD133 em tumores derivados de HT29 em comparação com as células HT29 parentais.
Após o sequenciamento do RNA, os genes com uma variação maior que uma dobra de log2 em sua regulação para cima ou para baixo com um valor P inferior a 0,05, conforme determinado pelo mapa de calor, podem ser plotados para distinguir os genes significativos entre tumores derivados de HT29 e células HT29 parentais. Neste experimento representativo, a análise dos genes regulados com uma dobra maior que uma dobra de log2 resultou em 10 genes de sementes, cruzando as redes genéticas. A análise do par de bases PANTHER indicou que dois genes estavam associados à regulação negativa da apoptose.
Além disso, os genes selecionados foram, consequentemente, validados pelo PCR quantitativo confirmando sua expressão aumentada em tumores derivados de HT29. A seleção diferencial de genes é o passo mais importante dos procedimentos. Lembre-se de usar uma alteração de 20 vezes maior que uma com recontagens superiores a 100 como critério.
Usando este protocolo, os genes selecionados a partir das tumores derivados da colorretal podem ser derrubados ou superexpressos para descobrir seus potenciais papéis na formação da tumorfera.
