Este trabalho foi financiado em parte por DK089016 e L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS), e P30-DK52574 (para a Universidade Central Washington Research Digestivo Doenças). AIT era uma Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow Formação.

1. Colite associada a indução de cancro <ol><li> Separe gaiolas de sexo e de mesma faixa etária 6-8 ratos semanas de idade para ser usado para grupos experimental e controle. Ratos podem ser individualmente rotulado com marcações da cauda ou clipes de ouvido. </li><li> No dia 0, os pesos de base de registo e injectar por via intraperitoneal a cada rato (IP) com 10 mg / kg de AOM solução de trabalho (1 mg / ml em solução salina isotónica, diluída a partir de 10 mg / ml de solução concentrada em dH2O mantida a -20 ° C) . Com base na experiência, esta dose pode ser ajustado entre 7-14 mg / kg e / ou repetida no início da experiência. </li></ol> Atenção: OMA é um agente volátil genotóxico e devem ser manuseados com cuidado de acordo com a MSDS acompanha. As diluições devem ser preparadas de um capuz químico, mantidos em gelo, e descartada seguindo protocolos específicos instituição. <ol start="3"><li> Fazer a 2,5% (2,5 g/100 ml) solução DSS em água destilada e passa através de um 0,22 mM de acetato de celulose filter por vácuo. Esta dose pode ser ajustada entre 1-3,5%, dependendo da estirpe de ratinho e de ambiente. Uma vez preparada uma solução, DSS pode ser mantido refrigerado durante até 1 semana. </li><li> No dia 7, solução de abastecimento DSS para ratos como sua água potável. Cerca de 250 ml / gaiola será necessária cada vez DSS novo é fornecido para um máximo de 5 murganhos / gaiola, no entanto, estes são apenas estimativas e irá variar dependendo do tipo de garrafas de água usadas na sua instalação para animais. </li><li> Para garantir um suprimento contínuo de DSS por sete dias, a solução DSS deve ser substituído em garrafas limpas três vezes (a cada 2-3 dias) durante esse período. Alguns investigadores medir a quantidade de DSS consumidos antes da substituição com a solução de novo como uma medida da exposição. </li><li> No dia 14, comutar gaiolas de volta à água potável normal durante duas semanas. </li><li> Repita os passos (1.4) - (1.6), nos dias 28 e 49 para proporcionar um segundo e terceiro ciclos de DSS. Um &quot;ciclo&quot; DSS consiste de uma semana de DSS na água potávelseguido de 2 semanas de água (autoclavado) regular. </li></ol> 2. Colite Avaliação clínica e progressão do tumor <ol><li> Ratos deve ser pesado / observados 2-3 vezes por semana. Perda por cento em peso em relação à linha de base é utilizado como uma medida substituta da severidade da colite. Avaliações regulares de sangramento retal, diarréia, ou prolapso podem ser feitas dependendo objetivos experimentais e relatados de acordo com vários sistemas de pontuação. 9, 10 </li><li> Uma perda de peso de até 10%, juntamente com 2-3 dias de diarreia e sangramento rectal pode ser esperado na semana após um ciclo completo de DSS (observação diária pode ser útil durante este período de pós-DSS imediata). </li></ol> É possível que alguns ratos não podem recuperar; ratinhos perdem mais de 20% do seu peso é menos provável que sobrevivem e podem exigir a eutanásia precoce. Uma injeção de IP único de 0,5-1,0 ml de solução salina em camundongos tais pode ser uma medida útil de apoio para corrigir flui<html> o volume d perdido devido à diarreia. 3. Murino Endoscopia (Opcional) <ol><li> Endoscopy seguindo o ciclo de segunda ou terceira de DSS podem ser realizados para confirmar o crescimento do tumor in vivo antes do sacrifício. Como o AOM / modelo DSS é bastante confiável na produção de tumores, este passo não é geralmente necessário. Apenas alguns ratos deve avaliadas utilizando este método, uma vez que tem o potencial para destruir tumores de ratos 11. </li><li> Anestesiar o rato com sedação inalatória ou injetável. </li><li> Depois de mouse é anestesiado, garantir o mouse para uma tábua plana com fita na cauda e no peito. </li><li> Avançar o endoscópio murino no reto do rato delicadamente com soro fisiológico para inflar e irrigar a melhorar a visão intraluminal e remover conteúdo fecal. (Note-se que a endoscopia também pode ser realizada usando insuflação de ar, como uma alternativa à solução salina e esta técnica pode oferecer visualização melhorada do tumor 12.) </li></ol>e &quot;Sacrifice&gt; 4. Rato e colheita Colon <ol><li> No dia 70, cada rato OMA / DSS tratada deve abrigar vários tumores de cólon e estar pronto para a avaliação. Esta data pode ser adiada semanas a meses se tumores maiores são desejados. (De notar que os ratos com grave prolapso rectal podem ter de ser sacrificados antes para evitar desconforto excessivo para animais de acordo com as comissões institucionais de cuidados com animais.) </li><li> Antes de necropsia, individualmente eutanásia ratos com luxação isoflurano e cervical (ou método institucionalmente aprovado outro). Peso final e outras medições podem ser feitas neste momento. </li><li> Coloque o mouse com o lado ventral exposto em uma placa de corte. Cobrir o abdómen com etanol a 70% para evitar a contaminação de cabelos de os conteúdos abdominais durante a extracção do cólon. </li><li> Use uma pinça para agarrar a linha média do abdome e fazer uma pequena incisão para expor o peritônio. </li><li> Estender esta incisão em cada lado do abdómen ao longo da margi costaln. </li><li> Utilize uma tesoura para cortar através da pélvis de modo a que o cólon pode ser colhido para baixo para a junção anorretal. Isto é importante porque DSS lesão colite é maior no recto distal e, correspondentemente, esta é a região de maior desenvolvimento do tumor. </li><li> Outros tecidos, tais como os nódulos linfáticos mesentéricos também podem ser colhidas no momento. </li></ol> 5. Preparando o Colon para análise macroscópica <ol><li> Utilizando uma agulha de gavagem 18G ligada a uma seringa de 5 ml, lavar o cólon com gelado salina tamponada com fosfato (PBS), de tal modo que as saídas de fluido na direcção fisiológico. Se o tecido de cólon será usado para RNA ou proteína baseada em análise, pode ser mantido frio, empregando tabuleiros pré-resfriada trabalho. </li><li> Abra o cólon corado longitudinalmente ao longo de seu mesentério e pintura na bandeja frio. Os tumores são mais facilmente visualizados quando o cólon é colocado sobre uma superfície escura. Alternativamente, a 1% de corante azul Alcian pode ser aplicado para realçar tumors. Avaliar o número e tamanho do tumor com uma régua ou paquímetro digital. </li><li> Pequenas secções de tumor e tecido normal adjacente pode ser excisado, neste ponto para análise posterior por RNA, proteína, ou imunohistoquímicos (IHC) métodos, permitindo que uma parte do cólon remanescente para a avaliação histológica. </li></ol> A fotografia digital das amostras brutas de cólon imediatamente após a etapa 5.2 pode ser útil para a análise precisa da carga de tumor, especialmente se porções significativas dos cólons são excisadas por outras formas de análise, tal como descrito acima. Carga tumoral (%) pode ser calculado como área de tumor / área total de cólon usando software livre, como o ImageJ. 6. Preparando o Colon para avaliação histológica <ol><li> Aplicar formalina a 10% para o cólon remanescente na bandeja frio por meio de seringa ou do dedo. Permitindo que o tecido para fixar, pelo menos, 30 s deste modo facilita a transferência para a bacia de fixação. Certifique-se de formalina residual é wiped fora antes da pintura um cólon novo, inaugurado na mesma bandeja. </li><li> Transferir pontos para uma bacia cheia de formalina a 10% e fechar nas bordas. </li><li> Depois de 3 horas de fixação, para transferir dois pontos de etanol a 70%. Cólons pode ser preservada em etanol a 70%, por tempo indeterminado. </li><li> Três secções longitudinais de dois pontos (proximal, médio, distal / reto) pode ser estabilizado em ágar 2% e submetidos para inclusão em parafina. Assegurar que o cólon proximal e distal do cólon / recto são orientados de uma maneira uniforme para cada rato. </li><li> Displasia, dano da cripta, e inflamação podem ser descritos e avaliados por uma pessoa experiente de acordo com protocolos anteriormente publicados. 10, 13-15 ratos podem ser sacrificados antes do dia 70, se o experimentador está interessado na detecção de eventos precoces displásicas. </li></ol> 7. Resultados representativos O modelo OMA / DSS aqui descrito permite ao pesquisador confiável gerar tumores de cólon em camundongos.O crescimento do tumor neste modelo é directamente influenciada pelo processo inflamatório associado. Gravidade da colite devem ser monitorizados clinicamente por perda de peso e depois a presença de diarreia / hematoquezia (Figura 2). Estes sinais de actividade da doença tende a começar no dia 5 do ciclo de DSS e por quatro ou mais dias após o DSS é removido. Raramente, os ratos com uma carga significativa do tumor retal pode desenvolver prolapso retal. Após o ciclo de diarreia segundo ou terceiro DSS pode tornar-se persistente. Tipicamente os tumores estão presentes e identificáveis ​​por colonoscopia murino antes do terceiro ciclo de DSS (figura 3). Tempo adicional e um terceiro prato de resultados DSS em tumores maiores no momento da colheita (Figura 4). Uso de aplicação tópica Alcian blue mancha pode ser usada para destacar tumores (Figura 5). Fotografias de tumores de cólon vai ajudar a gerar medições de tumor que podem ser utilizados para comparar quantitativamente produção tumor e tamanhoentre os grupos experimentais (Figura 6). Fixos e parafina espécimes embebidos cólon pode então ser avaliada por histologia ou com a utilização de coloração imuno-histoquímica (Figura 7 e 8). <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema de OMA e administração DSS. AOM (10 mg / kg) é injectado no dia 0. No início da segunda semana (7 dias), com solução 2,5% de DSS é administrada a ratos na sua água de beber. Sete dias de DSS é seguida por duas semanas de água autoclavada. Um adicional de dois ciclos de DSS são administrados antes do sacrifício. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura de peso do rato 2. Relação à linha de base durante OMA e administração DSS. Note-se que na semana seguinte a cada ciclo de DSS, ratos los<html> e 5-10% do seu peso corporal. A perda de peso neste experimento é um marcador para a gravidade da colite. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ver de tumores no cólon distal por meio de endoscopia murino do dia 50 de OMA / DSS tratamento. Observe as múltiplas massas polipóides obstruindo o lúmen do cólon distai (b, c) em relação ao cólon normal (a). <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Aberto longitudinalmente cólon do rato ilustrando aparência bruta de tumores. Note-se a mais elevada carga tumoral no cólon distai / recto (imagem superior esquerda), e a textura característica rugated do cólon proximal (imagem superior direita) com o crescimento do tumor pouco. Um fim acima da vista do cólon distal mostra inúmeros tumores de tamanhos variados (abaixo). &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; ove_content sempre &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Tumores destacados pela aplicação de Alcian mancha azul. Note-se como o corante enfatiza a textura normal do cólon, bem como as fronteiras de cada tumor individual. Essa coloração pode ser útil na medição precisa de áreas de tumor por régua ou medida digital. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Representante distribuição do número médio de tumores por rato tratados com AOM / DSS. Note-se a maioria dos tumores são localizados no cólon distai e são &lt;2 mm de tamanho. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig7.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 7. Secções embebidas em parafina longitudinais do cólon em cassete (acima), umd no slide seguinte H &amp; E mancha (abaixo). Note-se que Alcian azul residual mancha não interfere com H &amp; E de coloração. Um grande tumor está circulado na imagem do slide (círculo). As designações &quot;distal&quot;, &quot;média&quot; e &quot;resultado&quot; proximal de seccionamento todo o cólon em terços, entre o ceco eo ânus. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Histologia representativas de um tumor resultante do AOM / DSS administração no cólon distai. H &amp; E, BrdU, e β-catenina lâminas coradas em 50X (painel superior) e 400X (painel inferior), respectivamente, demonstram alterações displásicas semelhantes a adenocarcinomas humanos do cólon.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O tratamento de ratos com AOM e DSS rapidamente e eficazmente modelos colite associada a cancro humano. Hipóteses sobre hereditárias factores que contribuem para a colite cancros associados pode ser facilmente estudado em ratos geneticamente modificados. 13, 16 Alternativamente, o efeito de alvos farmacológicos de colite associada a cancro pode ser estudada utilizando ratinhos de tipo selvagem. Embora este modelo é altamente valorizado por aqueles interessados ​​no estudo ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Ratos C57BL/6J </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 000664 </td><td></td></tr><tr><td> Azoximetano (OMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5486-100mg </td><td> Solução stock: diluído a 10 mg / ml em água destilada para ser mantido à temperatura de -20 ° C, tal como 0,5-1 ul. Solução de trabalho: Diluir estoque de 1 mg / ml em isotónica (0,9%), solução salina </td></tr><tr><td> Dextran sulfato de sódio (DSS) </td><td> Consultoria TdB </td><td> DB001 </td><td> MW 40 kDa (36-50 kDa preparados a partir de outras fontes, são aceitáveis; O mesmo lote deve ser usado para uma única experiência) 6 </td></tr><tr><td> Coloviewsistema miniendoscopic </td><td> Karl Storz </td><td> Múltiplo </td><td> Veja Becker et al. Uma explicação detalhada de equipamentos e instalação. 11 </td></tr><tr><td> TPP rápida FilterMax 500 ml Frasco Filtrar, 0,22 PES </td><td> Centro-Oeste Científico </td><td> TP99500 </td><td> Qualquer filtro de tecido de cultura padrão é aceitável </td></tr><tr><td> Álcool Etílico 200 Prova ASC / USP </td><td> Fármaco-AAPER (ou outro) </td><td> 11ACS200 </td><td> Diluir a 70% em água destilada </td></tr><tr><td> USP, isoflurano </td><td> Butler Abastecimento Saúde Animal </td><td> 4029405 </td><td> Coloque o rato em frasco de vidro com gaze ou um pequeno pano embebido em anestésico </td></tr><tr><td> 18G agulha Gavage </td><td> Braintree Científica </td><td> N-008 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino (PBS) </td><td> SigmaAldrich </td><td> P5493 </td><td> Diluir a 1X (0,01 M) em água destilada </td></tr><tr><td> Bandeja frio (Tissue Tek Plate II Fria) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9491941 </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH (download gratuito) </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr><tr><td> Formaldeído (37%) </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td> Diluir a 10% em PBS </td></tr><tr><td> BD Bacto Agar </td><td> Fisher Scientific </td><td> DF0140-01-0 </td><td> Use hotplate para criar uma solução a 2% em água destilada </td></tr><tr><td> Molho Miltex Fórceps Eye </td><td> MedPlus Inc. </td><td> 18-780 </td><td></td></tr><tr><td> Olho Tesoura Miltex </td><td> MedPlus Inc. </td><td> 18-1430 </td> &lt;td&gt; pontos curvos evitar danos ao cólon durante a abertura. </td></tr><tr><td> Alcian Blue 8GX (pó) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5268 </td><td> Adicionar 1 g de pó em 100 ml de ácido acético a 3% (3 ml de ácido acético glacial + 97 ml de água destilada) </td></tr><tr><td> 1 ml seringa de tuberculina com anexo 26 G x 3/8 em bisel da agulha intradérmica </td><td> BD </td><td> 305946 </td><td> Para a injecção de OMA </td></tr></tbody></table>

modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (aom) and dextran sulfate sodium (dss)

Os indivíduos com a doença inflamatória do intestino (IBD), como a doença de Crohn (DC) ou a colite ulcerosa (UC) estão em risco aumentado de desenvolver cancro colo-rectal (CRC) nos indivíduos saudáveis. Este risco é proporcional à duração e à extensão da doença, com incidência cumulativa tão alta quanto 30% em indivíduos com UC de longa data com envolvimento do cólon generalizada. Uma displasia colônica em IBD e colite associada a câncer (CAC) Acredita-se que desenvolver como resultado de ciclos repetidos de lesão e reparação de células epiteliais, enquanto estas células são banhadas em meio de citocina inflamatória crónica. 2 Enquanto cancros espontâneos e colite associada a partilhar a qualidade de adenocarcinomas sendo, a sequência de eventos moleculares subjacentes acredita-se ser diferente. 3 Este distinção argumenta a necessidade de modelos animais específicos do CAC. Modelos de ratos Existem actualmente vários para o estudo da CAC. Sulfato de dextrano sodihm (DSS), um agente com efeitos tóxicos directos sobre o epitélio do cólon, podem ser administrados na água de beber para ratos em vários ciclos para criar um estado inflamatório crónico. Com duração suficiente, alguns destes ratos desenvolvem tumores. 4 O desenvolvimento do tumor é acelerada, neste modelo, se administrado em um ambiente pró-carcinogénicos. Estes incluem os ratos com mutações genéticas em tumorigénese vias (APC, p53, Msh2), bem como ratinhos pré-tratados com agentes genotóxicos (azoximetano [OMA], 1,2-dimetil-hidrazina [DMH]) 5. A combinação de DSS com OMA como um modelo para a colite câncer associado ganhou popularidade por sua reprodutibilidade, potência, preço baixo e facilidade de uso. Embora eles têm um mecanismo comum, AOM foi encontrada para ser mais potentes e estáveis ​​em solução do que DMH. Embora o desenvolvimento de tumores em outros modelos requer geralmente de vários meses, camundongos injetados com AOM e subsequentemente tratados com DSS desenvolver tumores adequadas numas pouco como 7-10 semanas. 6, 7 Finalmente, AOM e DSS podem ser administrados a ratos de todo o fundo genético (knock out, transgénicos, etc), sem cruzamento de uma linhagem tumorigénico específico. Aqui, demonstramos um protocolo para a inflamação orientada tumorigénese do cólon em ratos, utilizando uma única injecção de AOM seguido por três ciclos de sete dias de DSS durante um período de 10 semanas. Este modelo induz tumores com alterações histológicas e moleculares muito semelhantes às que ocorrem em CAC humana e proporciona um modelo altamente valiosa para o estudo da quimioprevenção oncogénese e na doença. 8

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Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

Nós demonstramos um protocolo em que a administração do agente genotóxico azoximetano (AOM), seguido por três ciclos da pró-inflamatória de sódio sulfato de agente de dextrano (DSS) de forma rápida e consistentemente gera tumores do cólon em ratos com semelhanças morfológicas e moleculares para as observadas em humanos colite Associadas cancro.

Câncer de modelagem Colite Associada com Azoximetano (OMA) e sulfato de sódio Dextran (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

modeling-colitis-associated-cancer-with-azoxymethane-aom-dextran

Research

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Medicine

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

46.5K visualizações.  Washington University School of Medicine. Nós demonstramos um protocolo em que a administração do agente genotóxico azoximetano (AOM), seguido por três ciclos da pró-inflamatória de sódio sulfato de agente de dextrano (DSS) de forma rápida e consistentemente gera tumores do cólon em ratos com semelhanças morfológicas e moleculares para as observadas em humanos colite Associadas cancro.

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Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Curso de modelagem em Ratos - Oclusão da Artéria Cerebral Média com o modelo de Filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Medicina

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Descolamento de Retina modelo em roedores por injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully recapitulate early- and late-stage metastatic disease progression. Typical tumor implantation models utilize ectopic or orthotopic primary tumor implantation, but few include systemic spontaneous metastatic disease that mimics the clinical setting. This protocol describes the key steps to develop RCC disease progression stages similar to patients. First, it uses a highly metastatic mouse tumor cell line in a syngeneic model to show orthotopic tumor cell implantation. Methods include superficial and internal implantation into the sub-capsular space with cells combined with matrigel to prevent leakage and early spread. Next it describes the procedures for excision of tumor-bearing kidney (nephrectomy), with critical pre- and post- surgical mouse care. Finally, it outlines the steps necessary to monitor and assess micro-and macro-metastatic disease progression, including bioluminescent imaging as well provides a detailed visual necropsy guide to score systemic disease distribution. The goal of this protocol description is to facilitate the widespread use of clinically relevant metastatic RCC models to improve the predictive value of future therapeutic testing.&#160;

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

Models of spontaneous metastatic renal cell carcinoma (RCC) disease progression can be used for evaluating treatments in a clinically relevant setting. This protocol demonstrates different procedures for orthotopic kidney tumor cell implantation, proper nephrectomy, and finally outlines a necropsy guide for visual and bioluminescent scoring of metastatic burden and localization.

Modelagem espontânea metastático carcinoma de células renais (mRCC) em ratos após nefrectomia

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modelagem quimioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the extremely low delivery efficiency (&#60; 1%) to the olfactory mucosa that directly connects the brain. It is crucial to develop novel techniques to deliver neurological medications more effectively to the olfactory region. The objective of this study is to develop a numerical platform to simulate and improve intranasal olfactory drug delivery. A coupled image-CFD method was presented that synthetized the image-based model development, quality meshing, fluid simulation, and magnetic particle tracking. With this method, performances of three intranasal delivery protocols were numerically assessed and compared. Influences of breathing maneuvers, magnet layout, magnetic field strength, drug release position, and particle size on the olfactory dosage were also numerically studied.
From the simulations, we found that clinically significant olfactory dosage (up to 45%) were feasible using the combination of magnet layout and selective drug release. A 64 -fold higher delivery of dosage was predicted in the case with magnetophoretic guidance compared to the case without it. However, precise guidance of nasally inhaled aerosols to the olfactory region remains challenging due to the unstable nature of magnetophoresis, as well as the high sensitivity of olfactory dosage to patient-, device-, and particle-related factors.

This manuscript reviews the modeling and simulations of different protocols to deliver medications to the olfactory region in image-based nasal airway models. Multiple software modules are used to develop the anatomically accurate nose model, generate computational mesh, simulate nasal airflows, and predict particle deposition at the olfactory region.

Modelagem e Simulações de Olfativo Drug Delivery com controles passivo e ativo do nasal inalados Farmacêuticas Aerossóis

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the ...