Agradecemos a Mike W. Davidson (Florida State University) para a prestação de DNA plasmídeo que codificam proteínas fluorescentes. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder GM72048 (para DWP).

1. Preparação de amostras de gotículas proteína fluorescente Uma amostra de gota proteína fluorescente é constituída por uma emulsão 1-octanol/water com a proteína fluorescente que residem na fase aquosa. Esta emulsão está entre uma lâmina de microscópio e uma tampa de vidro 22 milímetros quadrados para aplicações de microscopia. <ol><li> Antes de fazer amostras de gotículas proteína fluorescente das lâminas e lamínulas de vidro devem ser limpas e revestidas com um agente hidrofóbico. </li><li> Limpa vidros, lavando 5 minutos com acetona e deixar secar por via aérea. (Opcionalmente, após a limpeza do vidro pode ser tratada por 30 segundos em um aspirador de plasma para obter resultados de revestimento ideal). </li><li> Prepare uma solução de 2% methyltrimethoxysilane em acetona e revestimento do material de vidro durante um minuto de incubação 2 nesta solução. Depois de remover o revestimento de vidro a partir da solução e deixar secar por via aérea. Em seguida, lavar com etanol 70% a partir de um frasco de spray e deixar secar novamente. (Opcionalmente, neste momento o vidro pode ser cozido por 1 hora a 80 ° C a ligação covalente o revestimento para o vidro). Vidro revestidas podem ser armazenados por pelo menos um mês. </li><li> Proteínas fluorescentes são purificadas como Seu proteína 6-tag de E. Coli 1. Medir o espectro de absorção da proteína purificada e preparar uma diluição de ações com uma densidade óptica de aproximadamente 0,1 em STE tampão (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA), contendo 0,1% de albumina bovina sérica (BSA) . Além disso preparar 10 ml de uma mistura 1:1 de buffer 1-octanol e STE em um tubo de 15 ml cônico e misture vigorosamente. Depois de deixar a mistura até que a separação de fase está concluída. A fase superior é o 1-octanol. (Atenção: 1-octanol Porque tem um cheiro forte, é importante usar um recipiente bem fechado por tudo o que entra em contato com o 1-octanol). </li><li> Para fazer a emulsão pipeta 45 mL 1-octanol e 5 mL de proteínas fluorescentes em um tubo de microcentrífuga. Toque no tubo algumas vezes com o dedo para começar a formação da emulsão e, em seguida, sonicate o tubo por 30 segundos em um banho de sonicação. Entretanto obter uma lâmina de microscópio revestidas e tampa de vidro pronto. Após sonicação a emulsão deve ser completamente nublado. Imediatamente após sonicação pipeta 4 mL de emulsão a partir do meio do tubo em uma lâmina de microscópio revestidas e cubra com uma tampa de vidro revestido. </li><li> Se o procedimento for feito corretamente a emulsão deve equitativamente distribuída entre a lâmina de microscópio e do vidro objeto. Dentro de minutos, a amostra deve ser estável, consistindo de ~ 10 mm de espessura gotículas fluorescentes com diferentes diâmetro. O maior gotas são perto do centro da amostra e os menores estão localizadas mais para as bordas. </li></ol> 2. Criação de um experimento fotoconversão O procedimento a seguir é uma estratégia geral para a criação de um experimento fotoconversão proteína fluorescente. Este procedimento pode ser aplicado para proteínas purificadas, bem como para as células vivas. <ol><li> Os parâmetros a seguir fornecem um ponto geral de partida para criar sua experiência fotoconversão: Objetiva de imersão 40x 1.3NA petróleo = Tamanho da imagem 512 x 512 pixels Varredura zoom = 4 Pixel tempo de permanência = ms 6. Z-resolução (tamanho pinhole) = 3 mm </li><li> Configure dois canais de detecção para a fluorescência inicial e photoconverted, bem como um &quot;canal fotoconversão&quot;. Neste exemplo, usaremos purificada mOrange2 proteína, que é um laranja-vermelho proteína fluorescente photoconvertible. As espécies de laranja é detectada através de 561 nm de excitação ea fluorescência é coletada entre 570 nm e 630 nm. As espécies photoconverted vermelho é detectada através de 633 nm de excitação ea fluorescência é coletada entre 640 nm e 700 nm. Para o &quot;canal fotoconversão&quot; select 488 nm de excitação e de fluorescência coletar entre 490 nm e 540 nm. (Nota:. Canais a imagem fotoconversão não é estritamente necessário) </li><li> Use o canal para a imagem latente da fluorescência inicial com a digitalização contínua para ajustar a potência do laser e ganhar detector de qualidade de imagem ideal. </li><li> Ativar o canal fotoconversão e selecione uma potência do laser de baixa. Iniciar uma série de imagens de lapso de tempo e aumentar gradualmente até que o laser fotoconversão significativos de branqueamento da fluorescência inicial é observado. Continuar a digitalizar até a fluorescência inicial é de aproximadamente 75% branqueada. </li><li> Desactivar o canal fotoconversão e ativar o canal de detecção para a fluorescência photoconverted. Iniciar um ganho de imagem com detector de altura e potência do laser de baixa e aumentar gradualmente a potência do laser até a fluorescência photoconverted é detectado. Uma vez que você detectar a fluorescência photoconverted você pode ajustar a potência do laser e ganhar detector de qualidade de imagem ideal. </li><li> Finalmente, a potência do laser utilizadopara fotoconversão, bem como a duração do fotoconversão precisam ser otimizados. Aumentando a potência do laser fotoconversão vai acelerar a taxa de fotoconversão, potência do laser no entanto muito vai photobleach a proteína. </li><li> Uma vez que a potência do laser ideal fotoconversão e duração foram determinados, estes parâmetros podem ser usados ​​para configurar um padrão fotobranqueamento ou módulo FRAP e do &quot;canal fotoconversão&quot; não é mais necessário. </li></ol> 3. Dual-sonda destacando óptica com mOrange2 e Dronpa Por causa do vermelho-deslocado propriedades espectrais, mOrange2 pode ser usado em combinação com a proteína verde Dronpa photoswitchable fluorescentes para dual-sonda destacando óptico para permitir destacando seletiva de 4 células individuais (organela) populações. <ol><li> As células são cultivadas em placas de vidro de fundo Mattek e transfectadas 24 horas antes da imagem utilizando transfecção Lipofectamine2000 padrão 1. </li><li> Configure o microscópio para mOrange2 fotoconversão como descrito na seção 2. </li><li> Configure o microscópio para photoswitching Dronpa. Dronpa fluorescência pode ser fotografada usando o &quot;canal fotoconversão&quot; mOrange2 (ver passo 2.2). (Nota: Minimize a potência do laser usado para imagens Dronpa, porque o poder do laser demais fará com que a inativação de Dronpa.) Adicione um canal para a fotoativação Dronpa. Usamos 800 nm de dois fótons de excitação para fotoativação, mas esta alternativa pode ser conseguido usando excitação 405 nm. Determine a potência do laser necessária para imagem, fotoativação, e photoinactivation Dronpa de fluorescência. </li><li> Atenção: fotoconversão de mOrange2 e inativação de ambas as Dronpa ocorrer após excitação 488 nm. Devido à potência do laser de alta exigido para mOrange2 fotoconversão isso também inativar Dronpa fluorescência. Por outro lado, a inativação Dronpa ocorre já na potência do laser muito mais baixo e pode ser realizada sem fotoconversão mOrange2 significativa. </li><li> Uma vez que os parâmetros para mOrange2 fotoconversão e photoswitching Dronpa são definidas, destacando sonda dupla óptica é conseguido através dos seguintes passos. Primeiro, inativar Dronpa fluorescência em todo o campo de visão com baixo poder de excitação nm 488. Em segundo lugar, selecione uma região de interesse e mOrange2 photoconvert com alto poder de excitação nm 488. Finalmente, selecione uma região de interesse para ativar Dronpa fluorescência. </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Gota a preparação da amostra. A) amostra gota corretamente preparado. B) Amostra preparada sem revestimento da lâmina de microscópio e tampa de vidro. C) Amostra preparado sem adição de BSA de 0,1%. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Efeito do poder fotoconversão laser e duração de mOrange2 fotoconversão. Gotículas contendo Único mOrange2 proteína foram continuamente photoconverted usando diferentes quantidades de potência do laser 488 nm. Potência do laser usado para fotoconversão relativa foi de 10% (sólido), 25% (tracejada), e 100% (pontilhada). A) as espécies de laranja fluorescente. B) Photoconverted vermelho espécies fluorescentes. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Dual-sonda destacando óptica com mOrange2 e Dronpa. A Cell) expressando mOrange2-histona H2B e Dronpa-Mito antes fotoconversão, mostrando fluorescência laranja no núcleo e fluorescência verde na mitocôndria. B) Dronpa fluorescência foi desligado com baixo poder de excitação nm 488, causando fotoconversão mínimo de mOrange2. C) mOrange2 foi photoconverted para vermelho com alto poder de excitação nm 488. D) Dronpa fluorescência foi ligado novamente usando 800 nm 2 photon-excitação. Os painéis são superposições de imagens de fluorescência, juntamente com a imagem de contraste de interferência diferencial.

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A amostra purificada gota proteína fluorescente é um formato de amostra muito conveniente para a caracterização fotofísicas de proteínas fluorescentes, por exemplo para estudar fotobranqueamento cinética e cinética fotoconversão. O volume de gotículas extremamente pequenas (~ 20 picolitros) facilita a fotodegradação e experimentos fotoconversão, que pode ser difícil de executar em sistemas baseados cuvete. Além disso, como mostrado aqui a amostra de gota é ideal para a criação de um microscópio confoc...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

Photoconvertible proteínas fluorescentes (pc-PQ) são uma classe de proteínas fluorescentes com &quot;óptica highlighter&quot; capacidade, o que significa que a cor da fluorescência pode ser alterada pela exposição à luz de um comprimento de onda específico. Destacando óptico não invasivo permite marcação de uma subpopulação de moléculas fluorescentes e, portanto, ideal para acompanhar uma única célula ou organelas. Parâmetros críticos para fotoconversão eficientes são a intensidade eo tempo de exposição da luz fotoconversão. Se a intensidade é muito baixa, fotoconversão será lento ou não ocorrer. Por outro lado, a intensidade ou exposição muito muito tempo pode photobleach a proteína e, assim, reduzir a eficiência do fotoconversão. Este protocolo descreve uma abordagem geral como configurar um microscópio laser confocal para aplicações pc-FP fotoconversão. Primeiro, vamos descrever um procedimento para a preparação de amostras de gotículas de proteína purificada. Este formato de amostra é muito conveniente para estudar o comportamento fotofísicas de proteínas fluorescentes sob o microscópio. Em segundo lugar, vamos usar o exemplo de gotículas de proteína para mostrar como configurar o microscópio para fotoconversão. E, finalmente, vamos mostrar como executar destacando óptica em células vivas, incluindo dual-sonda destacando óptica com mOrange2 e Dronpa.

Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Este protocolo descreve uma abordagem geral para realizar fotoconversão de proteínas fluorescentes em um microscópio confocal de varredura a laser. Descrevemos os procedimentos para a fotoconversão de amostras de proteínas puried, bem como para dual-sonda destacando ópticos em células vivas com mOrange2 e Dronpa.

Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K visualizações.  Vanderbilt University. Este protocolo descreve uma abordagem geral para realizar fotoconversão de proteínas fluorescentes em um microscópio confocal de varredura a laser. Descrevemos os procedimentos para a fotoconversão de amostras de proteínas puried, bem como para dual-sonda destacando ópticos em células vivas com mOrange2 e Dronpa.

Vídeo: Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biologia

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Cuidados e limpeza do microscópio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...