Para começar, pegue os hermafroditas C.Elegans adultos jovens sincronizados em um tubo de microcentrífuga. Adicionar 200 microlitros de tampão M9, contendo Poloxamer 188, Pluronic F127, e dois microlitros do reagente do kit de coloração ao pellet de minhoca. Cubra os tubos com papel alumínio para proteger os corantes da luz.
Deixe a mistura girar a 20 RPM por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, gire os vermes a 500 G por um minuto. Depois disso, remova a solução de coloração sem perturbar a pastilha de minhoca.
Lave as minhocas com tampão M9 três vezes e transfira-as para uma placa de ágar NGM semeada contendo o tratamento adequado. Lave as minhocas das placas em microtubos de centrífuga frescos com um mililitro de tampão M9. Depois, fixe os vermes com formol a 1% no gelo por 30 minutos.
E lave as minhocas com um mililitro de tampão M9 três vezes para remover qualquer formaldeído residual. Após a peletização das minhocas, aspirar a quantidade máxima de sobrenadante, mantendo o pellet intacto em 10 microlitros de M9. Em seguida, para preparar 2,5% de agarose, pese 0,125 gramas de agarose em um tubo de ensaio de vidro borossilicato de 10 mililitros. Adicione cinco mililitros de tampão M9 e dissolva a agarose aquecendo suavemente o tubo com um queimador de bunsen.
Transfira a agarose derretida para um banho seco a 75 graus Celsius. Adicione 100 microlitros da agarose derretida em um vidro de cobertura de microscópio glosser de convés usando uma ponta de um mililitro. Imediatamente, coloque outra lâmina perpendicularmente sobre a gota de agarose formando uma forma de cruz.
Após dois minutos, separe suavemente as lâminas empurrando o vidro da tampa superior deixando a almofada de agarose na lâmina da tampa inferior. Transfira as minhocas para a almofada de agarose com uma pipeta de vidro Pasteur. Use uma mecha feita de um lenço de laboratório para remover o excesso de líquido.
Em seguida, cubra as minhocas com uma tampa menor e aplique esmalte transparente na periferia para evitar a evaporação. Coloque o slide em uma caixa escura para protegê-lo da luz. Use um microscópio confocal para obter imagens dos vermes dentro de 24 horas nos comprimentos de onda apropriados usando uma lente de aumento de 60 vezes.
Em seguida, abra o software de imagem e clique com o botão direito do mouse na área cinza. No pop-up exibido, selecione aquisição. Ti2 almofada completa.
Aquisição de ND e tabelas de pesquisa. Sob a almofada cheia Ti2, selecione 60 vezes e ajuste o botão de foco fino do microscópio para colocar os vermes em foco. Em seguida, selecione o disco giratório e escolha a opção de binning de 16 bits.
Para cada filtro de fluorescência, defina o tempo de exposição para 500 milissegundos e 20 milissegundos para campo brilhante. Depois que esses parâmetros estiverem definidos, selecione executar agora e aguarde até que a imagem de saída seja gerada como um arquivo ND2.
