This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Cepas, Cultura, e de Microscopia <ol><li> Manipular e manter cepas de C. elegans como descrito anteriormente 19. As estirpes estão disponíveis a partir do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC). NOTA: As estirpes utilizadas nestas experiências foram CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) eu; o-8 (e1489 IV)) com proteínas de fusão GFP localizadas para mitocôndrias e núcleos; PJ727 (jls01 (mio-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); unc-54 :: lacZ V) com proteínas de fusão GFP localizadas ao aparato contrátil e PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); unc- 54 :: lacZ) V) com proteínas de fusão β-galactosidase localizadas para o citosol. </li><li> Experimentos de ARNi completos como anteriormente descritos para as experiências com várias gerações de ARNi 13 e ARNi obter bactérias a partir da sequência verificada biblioteca ORF-RNAi construído por Marc Vidal et al. 12. </li><li> Construir cepas contendo &lt;em&gt; CCIs 4251, jls01 ou CCIs 55 usando técnicas convencionais 20. Use esses transgenes para criar uma tensão para avaliar a estrutura da rede mitocondrial, organização miosina ou o estado de Proteostase, respectivamente. Atravesse as tensões em um mutante procura em um desses compartimentos sub-celulares em cada animal é desejado. </li><li> Usar o inibidor de PtdIns-3-quinase, LY-294002 (LY) como previamente descrito 21. Resumidamente, adicionar LY-294002 numa concentração final de 160 uM em cima de placas de OP50-semeado secos NGM. </li><li> Capturar todas as imagens usando um filtro de GFP para experiências baseadas em GFP e um microscópio com um filtro passa-triplo que permite imagens de canais vermelho, verde e azul, simultaneamente, para a avaliação do potencial de membrana vivo com C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, vulgarmente comercializado como MitoTracker Red CMXRos. Realizar análise de imagem e figura preparação em software de processamento de imagem. </li></ol><ol><li> Um mínimo de 1 dia antes necessário, fazer tampão M9 - 22,04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, NaCl mM 85,56 (concentrações finais), e esterilizar em autoclave. Uma vez arrefecida a 45 ° C, adicionar estéril MgSO 4 a 1 mM após a autoclavagem para evitar a precipitação 22. Permitir que a M9-se arrefecer a 4 ° C, e alíquota em tubos de 50 ml. </li><li> No dia da experiência, adicionar 3 ml de tampão M9 para uma única placa 9 cm, com elevados números de larvas L1. Lava-se a placa várias vezes por aspiração do líquido M9 e pipetagem contra a superfície do agar com a placa mantida num ângulo. </li><li> Lavar os L1 do a partir da placa e, em seguida, transferir o M9 para um tubo de ensaio de 10 ml usando uma pipeta. </li><li> Deixar durante 2,5 min para permitir que a maior adulto e posteriores animais fase larval a cair para o fundo do tubo de teste e os animais L1 menores permanecem perto do top do tampão M9. </li><li> Remover os melhores 500 ul de M9 no tubo de ensaio usando uma pipeta. Em seguida, pipetar as larvas M9 contendo L1 para uma nova placa NGM semeado com 500 mL OP50 sob um escopo dissecar. </li><li> Normalmente, o objectivo de transferir ~ 200-300 larvas L1 por placa. Monitorar diariamente das placas idade adulta e, se necessário, pegar os animais para novas placas NGM OP50 para evitar fonte de alimento OP50 sendo consumido. NOTA: Este é geralmente 1-3 gotas de M9 usando uma pipeta P1000, embora varie, dependendo, em grande medida o número de L1 do na placa original. </li><li> Se estudos prospectivos em animais individuais são desejados, uma vez que os animais atingem a idade adulta, pegar animais individuais para separar placas NGM semeados. Transferência animais cada 24-48 horas para separar os animais de larvas. </li></ol> 3. Movimento Ensaios 19 <ol><li> Um mínimo de 2 horas antes do início da experimentação, remover uma alíquota de 50 ml de M9 e deixar equilibrar à temperatura ambienteratura. </li><li> Escolha um único animal adulto em tampão M9 50 mL em uma lâmina de microscópio. </li><li> Contar o número de curvas do corpo esquerda e para a direita na 10 seg, onde uma curva para a esquerda e uma direita é igual a um acidente vascular cerebral. </li><li> Repetir a contagem de acidentes vasculares cerebrais do corpo para se obter um total de pelo menos 5 medições a partir do qual podem ser tomadas em média. Multiplique esses números por seis a dar a taxa de movimento por min. </li><li> Com uma pipeta, transferir o animal de volta para a placa de Petri. Este método permite a medição temporal do movimento ao longo de todo o tempo de vida em C. elegan s. </li></ol><img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: ensaios Movimento. Uma vez que os vermes são colhidos em buffer, uma para a esquerda (A) e um para a direita (B) curva são somados para dar um movimento completo(Acidente vascular cerebral). 4. Imagem de mitocondriais Redes e Sarcômeros em Wall Corpo Muscle <ol><li> NOTA: O mesmo protocolo aplica-se para a imagem latente, tanto da mitocôndria e sarcômeros. </li><li> Sincronize vermes como descrito anteriormente (Seção 1) e crescer para 48-60 horas a 20 ° C, quando eles vão chegar na idade adulta jovem. </li><li> Escolha 20 worms (representativas da placa) das placas em 20 l M9 em uma lâmina de microscópio. </li><li> Aplique uma lamínula e proceder à imagem usando um microscópio de fluorescência sob um filtro GFP (460-500 nm, a luz azul de excitação) em 40X. </li></ol> 5. Avaliação do Potencial de Membrana usando uma In Vivo Ensaio de Acumulação com MitoTracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) <ol><li> Sincronizar CB5600 (Secção 1), todas marcadas com GFP na mitocôndria de músculos, e crescer até à idade adulta precoce em NGM contendo OP50 para 48-60 hr a 20 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de DMSO para a alíquota de 50 ug de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O para produzir uma solução stock de 940,692 uM. </li><li> Tomar 1 ml da solução de estoque 940,692 pM e ressuspender em 199 ul M9 para criar uma solução de trabalho de 4,70 uM (4,70346 uM). Prepare esta em marrom tubos de 1,5 ml, porque C 32 H 32 Cl 2 N 2 O é fotossensível. </li><li> Preparar alíquotas de 20 mL da solução 4,70 mM (20 vermes adultos por 20 l alíquota) de trabalho. </li><li> Escolher 20 animais adultos em 20 ul de 4,70 uM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O em castanhos os tubos de 1,5 ml. Incubar a 20 ° C durante 1 hora. </li><li> Após a incubação de 1 hora, adicionar 1 ml M9 para os marrons tubos de 1,5 ml contendo os vermes, centrifugar a 2000 xg por 10 segundos e, em seguida, remover o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem antes de ressuspender a pellet verme e transferir os restantes 20 μl (contendo os vermes) para um slide para a imagem latente. </li><li> Tome imagens da mitocôndria com 40X de ampliação usando um filtro de passagem de triplo que permite a visualização de ambos os canais vermelho, azul e verde simultaneamente. Imagiologia utilizando o filtro de passagem tripla mostra a co-localização de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O com GFP localizada a mitocôndria que aparecem como laranja. </li><li> Tendo tomado uma imagem da mitocôndria alaranjado, foto-branquear o animal por 10 segundos usando a luz de comprimento de onda 540/25 nm em configurações máximas com todos os filtros removidos. Isto irá branquear a vermelho dentro das mitocôndrias e revelar a GFP mitocondrial só para confirmar co-localização em mitocôndrias musculares. </li></ol> 6. Avaliação da degradação da proteína muscular em C. elegans <ol><li> Sincronize PD55s (ou qualquer tensão contendo o transgene lacZ) sobre a placas NGM semeado com OP50 (Seção 1). Crescer para a idade adulta em 48-60 horas a 20 ° C. </li><li> Escolha 20 vermes adultos em 20 mL DDH 2 O em uma lâmina de microscópio. Tenha cuidado para tentar pegar apenas o verme, e não todas as bactérias com a picareta. Rotular a lâmina de microscópio a lápis. </li><li> Colocar no exsicador durante 30 min para secar e rachar a cutícula dos animais. Assegurar uma boa vedação em exsicador com massa em torno do selo. </li><li> Verifique a dessecação tem sido eficaz no âmbito de um escopo de dissecação (Figura 2). </li><li> Submerge a lâmina de microscópio em acetona gelada durante 3,5 min, em seguida, deixar a lâmina de microscópio sobre uma toalha de papel à temperatura ambiente durante 15 min para permitir que a acetona no slide a evaporar-se. Neste ponto descongelar o tampão de X-gal e à oxidação e permitir equilibrar à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2 mL X-gal para 100 mL de buffer oxidação e vortex suavemente para garantir isso é homogênea. Esta é a mistura principal tampão X-gal / oxidação. </li><li> Adicionar 20 ml da mistura principal tampão X-gal / oxidação para cada oárea riginal de 20 vermes. Inspecione sob um escopo dissecar para garantir a mistura principal cobre completamente todos os animais totalmente. Incline a lâmina de microscópio para mover o mix mestre sobre as áreas onde os animais não são cobertos. </li><li> Colocar a lâmina do microscópio numa câmara de humidade durante 1-2,5 h a 20 ° C. Animais imagem quando uma cor azul escuro está presente nos músculos da parede do corpo dos animais controle. Avaliar animais controle sob um escopo dissecar cada 15 minutos para determinar quando os animais deve ser trabalhada. </li></ol><img alt="A Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: Avaliação da degradação da proteína muscular utilizando ensaios β-galactosidase. (A) Os animais que contêm um transgene lacZ são colhidos a partir das placas de Petri de 20 ul ddH2O numa lâmina de microscópio (B). Os animais são dessecada e tornar-se fraturado <strong&gt; (C). Os animais são, em seguida, lavou-se em acetona (D). Uma vez que a acetona evapora a mistura principal tampão X-gal / oxidação é adicionado (E). O desenvolvimento da cor azul em animais de controlo é avaliada a intervalos de 15 min (FL) a partir de t = 0 min (F), até que uma cor azul escuro é obtida através do comprimento dos animais (L). Imagens de vermes são tomadas com ampliação de 2.5X na AE e 8X em FL. Aproxima C, D, F, G e L são 4X a ampliação original.

The authors have nothing to disclose.

Estes métodos permitem a exploração do músculo do macrophysiology de movimento para identificação de defeitos subcelulares que são suficientes para causar um defeito movimento. Quando combinados estes métodos permitem a análise detalhada do músculo. O conhecimento adquirido permite que mais testes de hipóteses orientada para o músculo que pertencem a fisiologia geral, fisiopatologia e envelhecimento. Movimento Ensaios Um defeito movimento indica uma perturbação da função neuromuscular normal. Isto pode ser específico para nervos ou músculos ou que pode ser comum entre os vários tecidos. As fases mais difíceis de completar ensaios movimento está selecionando vermes que são representativas da população e / ou o tratamento, e também garantir que o experimentador não ferir o animal em cima de transferência para M9. É importante ter um tamanho de amostra grande para se obter uma avaliação representativa e precisa do movimento. Quando o ensaio altamente canetaefeitos etrant, por exemplo, como freqüentemente visto em mutantes, uma amostra de dez animais cada avaliado para o movimento dez vezes é suficiente para encontrar diferenças estatisticamente significativas contra o tipo selvagem. No entanto, a simplicidade dos ensaios de circulação e facilidade de cultura de C. elegans significa que centenas de vermes podem ser rapidamente avaliado, a fim de garantir resultados quantitativamente robustos. Ao ensaiar os efeitos que aparecem presente em apenas uma parte de uma população que é importante para determinar qual a proporção da população parece ser afectada, bem como a gravidade dos defeitos nos animais mais afectados. Em tais situações, um maior número de animais deve ser avaliada, a fim de fornecer os dados mínimos para a proporção da população afetada. Frequentemente tanto de drogas e tratamentos de RNAi irá produzir defeitos graves movimento em uma pequena proporção da população. Em alguns casos, o aumento da dose do tratamento e ou o método de entrega irá aumentar a proporção de affected animais e curvas de resposta de dose de corrida pode ser útil para determinar a concentração óptima de um fármaco ou de RNAi. Uma segunda limitação de movimento neste ensaio é que os vermes são manipuladas para avaliar o movimento. Assim, os vermes são ambas estimuladas e submetido a algum grau de stress osmótico quando apanhado em líquido. O grau de stress osmótico pode ser limitada por meio M9 ou BU tampão 19, em oposição à água. Algumas dessas limitações são atenuadas medindo movimento habitual em placas utilizando sistemas de rastreamento disponíveis no mercado 34 ou plug-ins gratuitos para ImageJ 35. Medir a taxa de movimento de um animal pode fornecer informações importantes sobre a saúde geral do músculo, incluindo alterações na função que podem ser medidos ao longo da vida ea não-invasivo deste método é fundamental para futuros estudos da função muscular ao longo da vida. Imagens do aparato contrátil &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A tensão verme usado aqui para estrutura aparato contrátil imagem foi PJ727 36 que expressa uma proteína de fusão GFP miosina que está localizada a sarcômeros dentro dos músculos da parede do corpo. O uso deste esforço permite a visualização da estrutura do sarcômero em animais vivos. Semelhante ao ensaio de movimento descrito acima, uma das principais vantagens da utilização de GFP marcada sarcómeros para avaliar estrutura sarcómero é que o método é relativamente não-invasiva e, portanto, pode ser usado para seguir prospectivamente estrutura sarcómero em animais individuais ao longo do tempo de vida. A maior dificuldade com este método é que os vermes que está sendo fotografada ainda estão vivos e, portanto, em movimento, o que torna difícil obter imagens bem focadas. Vários métodos podem ser empregues para reduzir o movimento e fazer imagiologia mais simples; estes incluem anestesiar ou paralisar os vermes e imobilização através de pressão, sucção, ou o uso de uma solução de alta viscosidade. Cada um destes métodos de immobilizção tem a desvantagem de que ele pode-se alterar a função neuromuscular. Portanto, é essencial incluir controlos não tratados na análise apropriados. Também pode ser prudente utilizar, pelo menos, dois métodos independentes de imobilização para confirmar os resultados não são devido a problemas com o método de imobilização, dependendo de como amplamente utilizado o método de imobilização é escolhido para a questão em estudo. Aqui nós usamos simples pressão da lamela sobre o worm para induzir movimento reduzida. Depois de colocar a lamela, o líquido sob a lamela irá evaporar ea lamela, consequentemente, começar a produzir mais pressão sobre os vermes, normalmente isso leva 2-5 min para produzir o suficiente movimento reduzido para permitir a fácil criação de imagens. É essencial para monitorar estreitamente os vermes após a lamela foi introduzida como a pressão irá, eventualmente, aumentar o suficiente para fazer com que os vermes para rebentar a partir de uma pressão excessiva, tipicamente 10-15 minutos após a coAlém verslip. Tampão adicional pode ser introduzido com o auxílio de uma pipeta de ponta em torno das bordas da lamela para evitar lesão por esmagamento para os vermes. Verniz de unhas pode ser usado para selar as arestas da lamela de cobertura e impedir a evaporação, embora isto evita a recuperação de animais de sob a lamela de cobertura, se desejado. Da mesma forma, a utilização de grânulos de silicone na solução pode ajudar a reduzir a quantidade de pressão que os locais de lamelas sobre os vermes. Assim como com a avaliação de movimento de um defeito, é importante considerar a penetrância do efeito. Penetrância pode ser considerado alto se 80-100% dos animais apresentam um fenótipo na placa NGM, parcial se 21-79% e de baixo se ≤20% do visor população um afeto. Para efeitos altamente penetrantes, tamanhos de amostra menores podem ser usados ​​para produzir dados quantitativos significativos sobre defeitos sarcômero. Nos casos em que o efeito tem uma penetrância baixa, selecção de animais que exibem um defeito claro movimento em resposta a drogaou tratamento de RNAi pode ser útil no ensaio de defeitos sarcômero na maioria dos animais afectados pelo tratamento. No entanto, não é necessariamente o caso em que a extensão do efeito do tratamento em circulação e da estrutura subcelular é o mesmo. Assim, pode ser desejável para examinar a extensão dos defeitos presentes numa grande população, por exemplo, 100 animais. Isto permite a compreensão da distribuição de defeitos ao longo de uma população. Também pode ser desejável para examinar a extensão do defeito nos animais mais severamente afectados e / ou examinar a correlação entre a extensão da defeito sarcómero e extensão de defeito movimento. As dificuldades potenciais de lado, este método é mais rápido e mais fácil do que outros métodos de avaliação da estrutura do sarcômero. Esta velocidade e facilidade, no entanto, sujeita a uma limitação fundamental, sarcômeros contêm proteínas de fusão GFP não são inteiramente normal 37 e, portanto, a avaliação de sarcômeros interrompido deve ser confirmado utilizando métodos mais intensivos em trabalho adicionais.Estes métodos incluem o uso de luz polarizada 38, phalloidin coloração 39 e 40 de imunofluorescência indireta. Destes métodos, apenas a luz polarizada é relativamente não invasiva; os outros métodos requerem fixação e, por conseguinte, não pode ser utilizado em estudos prospectivos de animais individuais, e elas só podem ser usadas para confirmar, atravessar seccionalmente, os resultados de tais estudos. Imagens de mitocondriais Networks A estirpe sem-fim utilizado para as experiências de imagiologia mitocondriais foi CB5600 7 que expressa uma proteína de fusão de GFP localizada na mitocôndria e uma GFP β-galactosidase proteína de fusão localizada para os núcleos, tanto nos músculos da parede do corpo. Tal como acontece com o uso de PJ727 para sarcômeros de imagem, o uso desta estirpe permite a visualização da estrutura de rede mitocondrial em animais vivos. Assim, esta estirpe pode ser utilizada para avaliar alterações dinâmicas que ocorrem, por exemplo, reduzida mitochondrial fusão e / ou aumento de fissão mitocondrial 41. Além disso, como para sarcômeros de imagem, a maior dificuldade com este método é que os vermes sendo fotografada ainda estão vivas e em movimento, o que torna difícil obter imagens bem focadas. Embora vários métodos, como discutido em maior detalhe acima, pode ser empregue para reduzir o movimento, as mitocôndrias parecem ser particularmente sensíveis a intervenções que induzem a circulação reduzida. Por exemplo, o mais geralmente usado anestésicos componentes alvo da cadeia respiratória mitocondrial e são, por conseguinte, deve ser utilizada com precaução em estudos de estrutura normal e função mitocondrial. Do mesmo modo, a maioria dos agentes paralisantes deve ser utilizada com precaução em estudos de estrutura normal e função mitocondrial, tal como a maioria dos agentes paralisantes causar menos sinal para passar através da junção neuromuscular e desnervação funcional do músculo é suficiente para induzir a fragmentação mitocondrial. Os experimentos deste estudo utilizou pressão para imobilizar animaiss, mas outros têm usado com sucesso levamisol 42, embora seja essencial para os animais imagem imediatamente. Por último, vários contaminantes bacterianos em culturas, por exemplo B. subtilis, pode induzir a fragmentação mitocondrial; Por conseguinte, é essencial incluir controlos não tratados na análise apropriados. Para efeitos altamente penetrantes, tamanhos de amostras menores podem ser utilizados para produzir os dados quantitativos sobre os defeitos significativos de rede mitocondriais. No entanto, devido à prevalência de pequenos defeitos na rede mitocondrial, este pequeno número de animais é provável que seja o dobro do número necessário para a avaliação da estrutura sarcómero. Nos casos em que o efeito tem uma penetrância baixa, a selecção de animais que apresentam claramente um defeito de movimento em resposta a tratamento medicamentoso ou ARNi podem ser úteis no ensaio de defeitos mitocondriais na maioria dos animais afectados pelo tratamento. No entanto, como mencionado acima, não é necessariamente o caso em que omedida do efeito do tratamento em circulação e da estrutura subcelular é o mesmo. Assim, pode ser desejável para examinar a extensão dos defeitos presentes numa grande população, por exemplo 150-200 animais, bem como a extensão da perturbação nos animais mais severamente afectados e da presença ou ausência de extensão da perturbação com a extensão da defeito movimento. Outras estirpes com mitocôndrias marcado por fluorescência pode ser utilizada para confirmar os resultados obtidos em CB5600, contudo, o uso de diferentes proteínas fluorescentes podem influenciar a rede de linha de base das mitocôndrias. Por exemplo, a utilização de uma proteína RFP TOMM-20 de fusão de visualizar as mitocôndrias parece provocar um aumento de fragmentação mitocondrial da linha de base versus a utilização de GFP localizada 17 para as mitocôndrias. Enquanto outros métodos tais como microscopia electrónica de imunofluorescência e pode ser utilizado para avaliar a estrutura mitocondrial, eles não permitem a avaliação in vivo da dinâmica mitocondrial, porque um passo de fixação é exigird. Outros métodos, tais como a utilização de corantes para as mitocôndrias localizadas podem ser utilizados sem fixação e, por conseguinte, também pode ser usado no lugar de utilização de GFP localizada para as mitocôndrias. Como discutido na próxima seção, o uso de tais corantes também permite a avaliação in vivo bruto da função mitocondrial. Avaliando Membrana Mitocondrial Potencial In Vivo em C. elegans Uma variedade de corantes estão disponíveis para rotulagem mitocôndrias 28. Esses corantes proporcionam um método alternativo de visualização estrutura de rede mitocondrial em C. elegans vivos. Muitos destes corantes também permitir a avaliação em bruto de funcionalidade mitocondrial in vivo, porque eles se acumulam na mitocôndria com base no potencial de membrana mitocondrial. Aqui nós usamos C 32 H 32 Cl 2 N 2 O que é ingerido através deo tracto digestivo, com alguns adicionalmente entrar no sem-fim através da cutícula por causa da permeabilização proporcionada por ser dissolvido em 0,5% de DMSO. Após a entrada na célula C 32 H 32 Cl 2 N 2 O está oxidado e sequestrado pelas mitocôndrias, onde se liga aminoácidos contendo enxofre (por exemplo, metionina e cisteína). A formação destes complexos de corante-péptido significa C 32 H 32 Cl 2 N 2 O permanece nas mitocôndrias, uma vez marcados 28. Uma dificuldade fundamental com a utilização de corantes mitocondriais é que eles vão rotular todas as mitocôndrias no animal. Por isso temos realizado rotulagem em CB5600, da mesma estirpe acima descrita para avaliação do músculo estrutura de rede mitocondrial. Usando um corante vermelho mitocondrial, uma estirpe de vermes que expressam GFP em mitocôndrias do músculo, e um filtro de passagem de tripla, que é relativamente simples para a imagem apenas mitocôndrias no músculo, encontrando mitocôndrias que são Ogama de co-localização de corante vermelho e mitocôndrias GFP rotulados. O passo mais difícil na realização desta abordagem é co-localização de imagem porque o corante é em segundos sob luz fluorescente de alta intensidade-branqueada foto. Este efeito pode ser limitada, mantendo a fluorescência de baixa potência até que o experimentador está pronto para a imagem e, em seguida, ajustando a intensidade de fluorescência em conformidade. Uma vez que se tem experiência com o uso de corantes outra abordagem é utilizar microscopia confocal com Z-stacks a imagem apenas mitocôndrias no tecido direito; as redes mitocondriais no músculo são bastante distintos em comparação com outros tecidos. Infelizmente, a incapacidade de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O para deixar mitocôndrias 28 significa que, ao contrário das técnicas de sarcômero e imagiologia mitocondrial discutido acima, não pode ser usado para seguir prospectivamente perda da função mitocondrial com o tempo, a menos que C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oé adicionado em pontos de tempo discretos para separar populações de animais. Esta limitação pode ser ultrapassada pela utilização de corantes, tais como JC-10 que faz sair a mitocôndria após colapso do potencial 43 de membrana. As mitocôndrias também pode ser isolado a partir de C. elegans 30 para análises bioquímicas subseqüentes. Tal extracção permite a quantificação do potencial de membrana mitocondrial por quantificação da taxa de absorção do corante catiónico lipofílico utilizando citometria de fluxo ou um leitor de placa fluorescente 44. Tendo estabelecido um potencial de membrana mitocondrial prejudicada, também é possível determinar se a perda de gradiente de protões traduz-se numa perda de produção de ATP, utilizando um método à base de luciferase bioluminometric 45 sensível. Avaliando a degradação de proteínas em C. elegans A cepa verme usada aqui para avaliar a degradação da proteína muscular foi PD55, que contém uma β específica muscular-galactosidase, que é continuamente ao longo do desenvolvimento sintetizados até à idade adulta é atingido e que permanece estável no citosol para o próximo 72-96 hr 19. Assim, a medição dos níveis de β-galactosidase durante o desenvolvimento predominantemente indica o impacto das intervenções sobre a síntese do promotor miosina enquanto que a perda de β-galactosidase durante a idade adulta indica uma intervenção provocou aumento da degradação da proteína citosólica 19. O passo chave na avaliação da actividade β-galactosidase é eficaz para assegurar a dessecação. Falha eficazmente para desidratar os animais resulta em mau disposição do substrato X-gal e, portanto, pobres cor azul nos músculos da parede do corpo dos animais. Para garantir uma boa dessecação o selo do secador deve ser verificado e, a amostra deve ser verificado em 10/05 minutos de intervalo durante todo dessecação para avaliar o progresso (ou seja, a amostra de 20 l deveria ter secado dentro de 10 minutos e os restantes 20 miné assegurar a dessecação abrangente). O ensaio de β-galactosidase é um ensaio de actividade, por conseguinte, um controlo apropriado é essencial. Além disso, a coloração diminuiu de adultos em uma condição de tratamento relativamente ao controlo não prova de que está a ocorrer a degradação; pelo contrário, indica diminuição da actividade enzimática em resposta ao tratamento. Para confirmar a degradação, mais western blot de trabalho intensivo deve ser concluída contra β-galactosidase 13 e isso permite a degradação de proteínas quantificação em pequenas populações de vermes contados. Densidades banda Western blot pode ser quantificado usando ImageJ 46. Uma outra limitação deste método é que o uso de proteínas transgénicas não informar como alvos para fisiológicas de degradação e para tais respostas hipótese impulsionado western blots proteomic e / ou orientadas devem ser empregues 13. Por último, como a síntese da proteína transgénica utilizada nestes estudos é desligado no início da idade adulta 19 </sup&gt;, outros métodos deve ser utilizado quando se deseja analisar alterações na síntese de proteínas do músculo totalmente desenvolvida em C. elegans muscular; por exemplo, métodos de isótopos estáveis ​​ou radioativos.

O músculo é um tecido multifuncional, bem apreciado por seu papel na locomoção, sustentação postural e metabolismo. O desenvolvimento ea manutenção do músculo saudável requer a coordenação de vários processos celulares e componentes. Ou através de dano ou doença, a desregulação pode ocorrer, o que resulta na estrutura muscular alterada e / ou função. Declínio associado à idade na função muscular apresenta um encargo significativo para os orçamentos de saúde no mundo ocidental, uma vez que a massa muscular de 1,2 e, particularmente, força e resistência muscular 3-5 são negativamente correlacionados com a mortalidade. A medição de aspectos relacionados com a deterioração da função muscular, tais como a função mitocondrial alterada ou sarcômero interrupção, pode permitir uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes desenvolvimento muscular global e saúde. Elegans C aenorhabditis (C. elegans) é uma microscópicas bes nematóidest conhecido, pois foi o primeiro organismo multicelular a ter todo o seu genoma sequenciado 6, a primeira a ter genes silenciados usando RNAi 7, eo único a ter suas metazoan toda linhagem celular 8 e 9 de neuroanatomia determinado. C. elegans foi proposto pela primeira vez como um modelo para o estudo do controle genético do comportamento em 1974 por Sydney Brenner 10 e da importância deste trabalho e posterior foi reconhecida com o primeiro dos três prêmios Nobel concedidos a C. elegans pesquisadores. Cerca de 35% dos genes de C. elegans identificaram ortólogos em seres humanos, com C. elegans ser um organismo chave usada para compreender o controle genético do desenvolvimento muscular 11. Quase todos os genes no genoma C. elegans pode ser derrubado por meio de RNAi 7,12. Assim, derrubando genes no músculo totalmente desenvolvido, componentes genéticos contribuindo para a regulamento da saúde muscular pode ser investigada com relativa simplicidade 13. A capacidade combinada de usar RNAi, mutantes, e compostos químicos torna C. elegans um sistema premier para explorar a regulação genética 7,14,15 da estrutura e função muscular com 16 anos de idade e em modelos de doenças 17. O impacto de knockdown do gene, mutação, e / ou exposição a compostos químicos sobre a estrutura e / ou função do músculo pode ser medido através de vários aspectos. Aqui, descrevemos brevemente técnicas simples para avaliar C. elegans estrutura e função do músculo, muitos dos quais podem ser utilizados em estudos prospectivos de saúde muscular. O desenvolvimento da proteína verde fluorescente (GFP) 18 permitiu a visualização de ambos a localização de proteínas específicas e a estrutura geral de organelos em C. elegans. Aqui explicamos como GFP expressa especicamente dentro do corpo da parede muscular mitocôndrias, núcleos, ou sarcómeros pode ser utilizado para determinar se a distrofia destas estruturas sub-celular está presente. Como a estrutura não é sempre um substituto confiável para a função, nós também explicar como o uso de corantes catiônicos in vivo permite a avaliação do potencial de membrana mitocondrial prejudicada dentro do músculo. Quando os corantes são usados ​​em combinação com GFP, eles permitem o estudo da estrutura e funcionamento de uma forma temporal, durante toda a vida. Por último, nós também explicar como homeostase proteínas dentro do músculo pode ser avaliado e como todas essas medidas pode ser usado para correlacionar as mudanças na saúde músculo animal inteiro através da utilização de ensaios de movimento. Estas técnicas, combinadas com knockdown gene, mutações, e / ou compostos químicos proporcionam um poderoso arsenal para o estudo de como os genes ou compostos específicos influenciar a saúde do músculo in vivo. Os paralelos na estrutura, metabolismo e função do músculo bruta entre C. elegans emamíferos significa C. elegans é um organismo modelo excelente para a compreensão da regulação do músculo em organismos superiores, incluindo os seres humanos.

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		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O)</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td style="width:187px;">Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">67-63-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">KH2 PO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:103px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">301584L</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgSO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7506</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Microscopy Slides</td>
			<td style="width:103px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">K220</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Microscopy Cover Slips</td>
			<td style="width:103px;">VW2 International</td>
			<td style="width:119px;">631-0124</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">1.5ml Eppendorph Tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB74031</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Dessicator</td>
			<td style="width:103px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">D2672</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">H600L</td>
			<td style="width:187px;">Nikon H600L microscope with proprietary software</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Camera</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">DS-Fi1</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:195px;">Zeiss Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Ax10</td>
			<td style="width:187px;">Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Plates 9cm</td>
			<td style="width:103px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">82-1473</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:195px;">Plates 6cm</td>
			<td rowspan="2" style="width:103px;">Gosselin</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">BP53-01</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">Potassium Ferrocyanide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">14459-95-1&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgCl2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="61" rowspan="3" style="height:61px;width:195px;">Na3PO4</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7601-54-9</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="147" rowspan="3" style="height:147px;width:195px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7240-90-6&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">N,N8-dimethylformamide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">68-12-2&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

O músculo é um tecido dinâmico que responde a mudanças na alimentação, exercício e estado de doença. A perda de massa muscular e função com a doença ea idade são encargos significativos para a saúde pública. Atualmente, entender pouco sobre a regulação genética da saúde muscular com a doença ou idade. O nemátodo C. elegans é um modelo estabelecido para a compreensão da regulação genômica dos processos biológicos de interesse. Os músculos da parede do corpo deste verme apresentar um elevado grau de homologia com os músculos de espécies de metazoários mais elevados. Desde C. elegans é um organismo transparente, a localização de GFP para mitocôndrias e sarcómeros permite a visualização de estas estruturas in vivo. Similarmente, a alimentação de animais corantes catiónicos, que se acumulam com base na existência de um potencial de membrana mitocondrial, permite a avaliação da função mitocondrial in vivo. Estes métodos, bem como a avaliação de homeosta proteína muscularsis, são combinados com avaliação da função muscular animal inteiro, sob a forma de ensaios de movimento, para permitir a correlação de defeitos sub-celulares com medidas funcionais de desempenho muscular. Assim, C. elegans fornece uma plataforma poderosa para avaliar o impacto das mutações do gene, o knockdown, e / ou compostos químicos sobre a estrutura e função musculares. Por último, como a GFP, corantes catiónicos, e ensaios de circulação são avaliadas de forma não invasiva, estudos prospectivos da estrutura e função do músculo pode ser conduzida ao longo de todo o curso da vida e, actualmente, esta não pode ser facilmente investigada in vivo em qualquer outro organismo.

Movimento ensaios de quantificação Defeitos Movimento Declínio Movimento é um bom preditor de mortalidade em C. elegans 16, com a diminuição das taxas indicando problemas com o sistema neuromuscular. Alterações na circulação, tal como avaliado por ensaios de movimento, pode resultar de ARNi contra um gene específico ou tratamento da toxicodependência (Figuras 3-5) ou em animais mutantes 13, 23. Um declínio no movimento pode resultar de desenvolvimento alterado por exemplo, após batida de desenvolvimento para baixo de genes de transporte de elétrons que codificam complexo I, III, IV ou V 24. Adicionalmente, as intervenções específicas podem ser testados em adultos apenas C. elegans, a fim de investigar o efeito sobre a fisiologia pós-desenvolvimento. Por exemplo, os animais tratados com o ARNi contra unc-112, que codifica o ortólogo de C. elegans Kindlin-1, que está localizada a integrina contendocomplexos de fixação muscular (Figuras 3 e 4), ou gás-1, que codifica um componente do complexo I da cadeia de transporte de elétrons (Figura 4), ​​apresentar uma redução progressiva no movimento contra o controle 48-72 horas pós-vida adulta. Isto pode ser indicativo de problemas com a fisiologia muscular. De igual modo, uma perda de movimento 24-72 horas é observado em resposta ao tratamento de adultos normalmente desenvolvidos com o tratamento com o inibidor de PI3K LY-294002 (Figura 5). Também é possível testar o efeito de um segundo tratamento de RNAi, mutação, ou de uma droga no restabelecimento da circulação em animais que exibem uma redução do movimento em resposta a uma intervenção inicial. Por exemplo, unc- 112 mutantes exibem uma redução quantificáveis ​​em circulação em comparação com animais de tipo selvagem que é atenuado na presença de uma segunda mutação no dim-1 13. Assim, ensaios de movimento pode identificar ambas as intervenções que alteram neuromuscudesenvolvimento lar e / ou função, bem como aquelas que melhoram e / ou restaurar a função neuromuscular. Avaliação da Perturbação sarcômero Tendo identificado um defeito movimento, é muitas vezes desejável para determinar se a causa do defeito movimento pode ser explicado por problemas dentro de nervos, músculo, ou ambos. Sarcômeros são os complexos multi-protéicos dentro do músculo que permitem a contração e, assim, forçar a geração e movimento. Por animais que expressam proteínas de fusão utilizando miosina GFP localizadas ao aparelho contráctil, o grau de perturbação de filamentos de miosina e sarcómeros pode ser observado relativamente não invasiva e prospectivamente em animais individuais através do desenvolvimento e / ou a idade adulta. Do tipo selvagem animais exibir sarcômeros dispostos que aparecem como várias linhas verdes retas paralelas dentro de cada músculo-parede do corpo (Figura 3). A ruptura de estas matrizes normais pode ser relativamente menor comsarcômeros dispostos aparecem para mesclar ao invés de permanecer em paralelo. Este fenótipo, visível com unc-112 RNAi em t = 24 h ou 48 h (Figura 3), é comparável a Z-linha de transmissão de sítios de ligação à actina muscular em mamíferos. Do mesmo modo, as pequenas porções das matrizes podem entrar em colapso ou eles podem desaparecer completamente, tais como o tratamento com unc-112 RNAi em t = 48 h ou t = 72 h (Figura 3). A presença de defeitos sarcômero no interior do músculo de animais que exibem um defeito de circulação (Figura 3) é suficiente para explicar o defeito movimento, mas não necessariamente excluir outros problemas com o músculo, nervo, e / ou em outros tecidos em resposta a uma intervenção . Avaliação da Estrutura mitocondrial Rede Na presença de um defeito movimento é por vezes desejável para examinar músculo para outros defeitos que podem causar ou contribuir para o movimento defect. As mitocôndrias fornecer a maior parte da energia celular e declina em movimento pode ser o resultado da disposição de ATP reduzida, reduzindo a energia disponível para a contracção muscular. Assim, a estrutura da mitocôndria podem ser examinados para anormalidades. É importante que não se anestesiar os animais com azida de sódio, uma vez que induz a fragmentação rápida mitocondrial; animais nestas experiências foram imobilizados pela pressão aplicada pelo deslizamento da tampa. Dentro do tipo selvagem C. elegans muscular da parede do corpo, as mitocôndrias estão contidas dentro de redes organizadas (Figura 4) e existem mitocôndrias e funcionam como um retículo 25. O rompimento da rede de mitocôndrias apresenta como fragmentação da rede (gás-1 RNAi, Figura 4B) 26. A fragmentação pode tornar-se grave o suficiente para que nenhuma aparência de redes organizadas permanece como o tratamento com RNAi unc-112 (Figura 4B e C) 13. Como with rupturas na estrutura do sarcômero, defeitos no músculo estrutura mitocondrial em animais que apresentam um defeito movimento pode ser suficiente para dar conta do defeito movimento, mas isso não significa necessariamente descartar outros problemas com músculos, nervos, e / ou outros tecidos. Por exemplo, UNC-112 mutantes 13 e tratamento com UNC-112 RNAi (Figuras 3 e 4) exibição ambos os sarcômeros interrompidas e rompimento da estrutura mitocondrial. Avaliação da Função Mitocondrial In Vivo O potencial de membrana mitocondrial determina a capacidade das mitocôndrias para criar a força motriz de protões do ATP e 27 geram, por conseguinte, a capacidade de avaliar o potencial de membrana mitocondrial in vivo indica a capacidade desse animal para a produção de ATP. Como rupturas estruturais mitocondriais podem ou não alterar a capacidade funcional mitocondrial, pode ser desirable para avaliar a função mitocondrial em animais que apresentam a estrutura mitocondrial alterada. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O acumula nas mitocôndrias, de todos os tipos de células, onde um potencial de membrana está presente e manchas da mitocôndria 28 (Figura 4C). Para avaliar especificamente a função mitocondrial no músculo, pode-se usar C 32 H 32 Cl 2 N 2 O e GFP marcado mitocôndrias musculares para demonstrar os efeitos de uma intervenção especificamente sobre mitocôndrias musculares (Figura 4C). Por exemplo, a perda de potencial de membrana mitocondrial de tratamento seguinte com unc-112 RNAi impede C 32 H 32 Cl 2 N 2 O entrem na matriz. As mitocôndrias, por conseguinte, apresentam pouca, se alguma coloração vermelha da mitocôndria para além da rotulagem de mitocôndrias GFP (Figura 4C). Foto-branqueamento também pode ser utilizada para confirmar que o observadomitocôndrias são aqueles especificamente no músculo (Figura 4C). Identificação de uma reduzida capacidade para produzir ATP é suficiente para dar conta de um defeito movimento observado, mas não descarta outros problemas dentro do músculo, nervo, e / ou outros tecidos. Independentemente disso, como a redução da capacidade de produção de ATP está associada com estados de doença em seres humanos 29 e 30 de envelhecimento, a identificação de um tal defeito na resposta a uma intervenção proporciona uma plataforma para o rastreio de compostos e / ou tratamentos de ARNi que melhoram a capacidade de produção de ATP e estes podem, em seguida ser mais explorado para potencial terapêutico. Avaliação da degradação de proteínas Na presença de um defeito de movimento e sarcómeros normais e mitocôndrias é por vezes desejável para examinar músculo para outros defeitos que podem causar ou contribuir para o defeito movimento. A capacidade de manter a homeostase de proteína é uma assinatura de nemmal de saúde, enquanto que uma redução na síntese de proteínas e / ou um aumento da degradação de proteínas é uma consequência do envelhecimento 31 e vários estados de doença 32,33. Portanto pode ser desejável para examinar os músculos de animais com um defeito de movimento para a homeostase proteína alterada. Isto pode ser realizado através de avaliação dos níveis de proteínas musculares citosólicas. A utilização de proteínas transgenicamente codificados permite a avaliação de Proteostase específica do músculo. Por exemplo, o uso de animais contendo β-galactosidase, fundida com uma porção N-terminal da miosina, que é sintetizado sob o controlo de um promotor da miosina e potenciador permite a avaliação do teor de proteínas do músculo citosólico 19. A presença de corante azul de tipo selvagem em adultos demonstra a presença de β-galactosidase activa e a ausência de degradação da proteína citosólica patológica. Uma perda de coloração em resposta ao tratamento sugere a degradação da proteína patológica está a ocorrer (Figura 5 </strong&gt;), Como β-galactosidase é estável durante 72-96 horas após a idade adulta em adultos de tipo selvagem 13,14,19. Por exemplo, animais de tipo selvagem não tratados exibir uma intensa mancha azul 72 h após a idade adulta, enquanto que LY-249002 animais tratados exibir uma ausência de mancha (Figura 5). Tal como acontece com defeitos na estrutura do sarcômero e função mitocondrial, a presença de degradação de proteína muscular patológico é suficiente para dar conta de um defeito movimento observado, mas não necessariamente descartar outros problemas com músculos, nervos, e / ou outros tecidos. <img alt="A Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: (A) unc-112 RNAi provoca um defeito movimento significativo em t = 72 h (B) Avaliação da estrutura A-banda dispostas dentro do músculo da parede do corpo.. Em wt, A-bandas no músculo aparecem como linhas retas no início da vida adulta (t = 0 h) e permanecem em grande parte uniforme até além de 72 horas de vida adulta (ver zoom peso). unc-112 RNAi faz com que os sarcômeros perder arquitetura em pequenas áreas de músculo (t = 24 h), entrou em colapso e sarcômeros em falta (t = 48 h), a agregação (painel superior t = 72 horas e zoom) e perda de linearidade de sarcômeros (painel inferior t = 72 horas e zoom). Barras de escala representam 25 mM e zooms são 2.5X. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4: (A) unc-112 ou gás-1 RNAi provoca um defeito de circulação (B) Avaliação da estrutura mitocondrial dentro do músculo da parede do corpo.. As mitocôndrias no músculo aparecer linhas retas como em rede na idade adulta jovem (em peso). O tratamento dos animais com unc-112 resulta em RNAi mitochondrfragmentação ial como observado anteriormente entre 24 horas e 72 horas da vida adulta (zooms e flecha) 13. Da mesma forma, RNAi contra gás -1 resulta em fragmentação das redes mitocondriais como observado anteriormente 26. Estes estão presentes como pequenas lacunas na rede mitocondrial em t = 24 horas e progresso para a desorganização generalizada a 72 hr (ver zoom e flecha). (C) Avaliação do potencial de membrana mitocondrial in vivo. Em animais também contendo GFP localizada a mitocôndria, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O acumula na mitocôndria do músculo da parede do corpo e aparece laranja sob um filtro de passagem de triplo da vida adulta (t = 0 horas) até 72 horas após a idade adulta. O tratamento com unc-112 RNAi provoca uma perda progressiva do potencial de membrana, conforme mostrado em 72 h onde as mitocôndrias restantes mostram menos acumulação de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O em peso vs. Fotodegradação de 10 sec usando alvejantes 540/25 nm luz vermelha do MitoTracker e revela a GFP localizada mitocôndrias musculares (+ Foto lixívia). Barras de escala representam 25 mm e zooms são 2.5X. <img alt="A Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5: (A) O tratamento com LY-294002 animais induz um defeito de movimento (B) Avaliação da degradação de proteínas utilizando um ensaio de β-galactosidase.. Idade sincronizado em peso larvas L1 são cultivadas para a idade adulta a 20 ° C (t = 0 h) antes de transferir para NGM semeada com OP50 (controlo de peso) ou NGM semeada com LY-294002 (tratamento com inibidor de PI3K) durante 24 horas a 20 ° C . Em A, cerca de 20-30 animais estão manchadas de atividade β-galactosidase (azul) em t = 0 horas e após 24 horas, 48 ​​horas e 72 horas.

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Métodos para avaliar os compartimentos subcelulares do músculo em C. elegans | Biologia | Vídeo

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

O músculo esquelético é essencial para a locomoção e é a principal loja de proteína dos corpos. Medidas de saúde musculares dentro de C. elegans são descritos. Mudanças potenciais na estrutura e função muscular são avaliados usando GFP localizada e corantes catiônicos.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

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Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

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16.4K visualizações.  University of Nottingham.  O músculo esquelético é essencial para a locomoção e é a principal loja de proteína dos corpos. Medidas de saúde musculares dentro de C. elegans são descritos. Mudanças potenciais na estrutura e função muscular são avaliados usando GFP localizada e corantes catiônicos. 

Vídeo: Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...