Depois de criar imagens do C.elegane tratado com drogas, abra o arquivo ND no servidor J de imagem com o plug-in de colocalização e selecione a opção de imagens divididas na caixa de diálogo. Cada arquivo ND contém planos de imagem tirados em três comprimentos de onda e luz visível. Trabalhe com imagens de campo brilhante, verde e vermelho.
Gere duplicatas dessas imagens para manter a imagem original intocada, clicando na imagem e selecionando duplicar ou usando o atalho de teclado shift mais D.Em seguida, reduza o plano de fundo gerando outra duplicata de imagem, conforme demonstrado anteriormente. Subtraia o plano de fundo com um raio de rolagem de 100 e selecione a opção criar plano de fundo para gerar uma imagem com o plano de fundo da imagem fornecida. Agora vá para o processo, clique na calculadora de imagem e subtraia a primeira imagem duplicada da segunda imagem duplicada.
Use as imagens resultantes para a análise de colocalização. Para usar o plugin de colocalização, converta as imagens do canal verde e vermelho em oito bits clicando na imagem, selecionando o tipo, seguido de oito bits. Em seguida, clique em plugins e selecione colocalização.
Para medir a colocalização dos sinais mitocondriais e lisossomos, defina a razão para 75%, o canal vermelho limiar para 80,0 e o canal verde limiar para 50,0. Uma imagem binária de oito bits contendo puncta colocalizada e combinando as três imagens de oito bits em uma imagem RGB é gerada como saída. Em seguida, concentre-se no puncta no músculo da parede do corpo da cabeça dos vermes selecionando manualmente a área e criando uma máscara clicando em editar, selecionar e criar máscara para selecionar a região de interesse.
Para selecionar as partículas na região de interesse, use a calculadora de imagens para selecionar as imagens colocalizadas de oito bits e mascaradas. Utilizar a operação e selecionar o ponto na região de interesse gerando uma imagem com ponto na região de interesse. Finalmente, para analisar a área das mitocôndrias e lisossomos colocalizados, selecione-se a análise, seguida de analisar as partículas e medir a soma dos pontos entre 0,1625 micrômetros quadrados e quatro micrômetros quadrados.
As imagens confocais dos músculos da parede do corpo da cabeça dos vermes mostraram colocalização de mitocôndrias e lisossomos. A VL-850 induziu mitofagia robusta nos músculos da parede do corpo da cabeça do verme, indicando um potente indutor de mitofagia. A potência mitofágica do VL-850 foi semelhante à do FCCP.
