Após a obtenção de imagens das células Hep-3B tratadas com a droga, abra as imagens confocais na imagem J com o plugin de colocalização. Abra o arquivo ND no servidor J da imagem e selecione a opção de canais divididos na caixa de diálogo. Trabalhe com imagens verdes e vermelhas.
Gere duplicatas dessas imagens para manter a imagem original intocada, clicando na imagem e selecionando duplicar ou usando o atalho de teclado shift plus D.To reduzir o plano de fundo, gerar outra imagem duplicada, subtrair o plano de fundo com um raio de rolamento de 100 e selecionar a opção criar plano de fundo para gerar uma imagem com o plano de fundo das imagens dadas. Em seguida, vá para o processo. Clique na calculadora de imagem e subtraia a primeira imagem duplicada da segunda imagem duplicada.
Utilize as imagens resultantes para a análise de colocalização. Para usar o plugin de colocalização, converta as imagens do canal verde e vermelho para 8 bits clicando em imagem, selecionando tipo, seguido por 8 bits. Em seguida, clique em plugins e selecione colocalização.
Para medir a colocalização dos sinais mitocondriais e lisossomos, defina a razão para 75%, o canal vermelho limiar para 80,0 e o canal verde limiar para 50,0. Uma imagem binária de 8 bits contendo puncta colocalizada e combinando as três imagens de 8 bits em uma imagem RGB será gerada. Converta essas imagens em imagens de 8 bits.
Para obter a região de interesse das células, gere uma imagem que destaque a área das células selecionando a imagem de um ponto colocalizado. Para selecionar toda a área da célula, selecione a imagem de pontos colocalizados resultante e clique na imagem, ajuste o limite e defina o limite para garantir que toda a área da célula seja realçada. Para analisar a área da célula, selecione analisar, clique em analisar partículas e meça todas as partículas na imagem de zero ao infinito, a configuração padrão para analisar partículas.
Para analisar a área das mitocôndrias e lisossomos colocalizados, selecione a imagem colocalizada de 8 bits. Em seguida, selecione analisar. Clique em analisar partículas e medir a soma de puncta entre 0,1625 micrômetros quadrados e quatro micrômetros quadrados.
Divida a área das mitocôndrias e lisossomos colocalizados pela área celular total para medir os pontos colocalizados. As imagens confocais das células Hep-3B mostraram colocalização de mitocôndrias e lisossomos. VL 850 e FCCP induziram mitofagia significativa nas células Hep-3B.
