Este trabalho foi apoiado por prêmios de HHMI 56006760 para JDV, o National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) para DMAW, e da Fundação Médica Ellison (AG-SS-2465) e do NIH (GM45735, GM45735S1 e GM096445) para LP. GM45735S1 foi emitido a partir do NIH sob a Recuperação Americana e Reinvestimento de 2009. Os microscópios utilizados para estes estudos foram apoiados, em parte, através de uma subvenção NIH / NCI (5 P30 CA13696).

1. Transformação de células de levedura com o Biossensores <ol><li> Transformar a estirpe de levedura com o plasmídeo desejado Mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 usando o método do acetato de lítio 27. </li><li> Para confirmar a transformação com o plasmídeo de biossensor de origem e para evitar a perda do plasmídeo, seleccionar e manter os transformantes no meio completo sintético selectivo apropriado (SC-Ura para Mito-roGFP, ou SC-Leu por mitGo-ATeam2). Se a sonda fluorescente foi subclonado num plasmídeo diferente do que os descritos aqui, o uso do meio selectivo apropriado. Visualiza transformantes por microscopia de fluorescência para confirmar que elas expressam o biossensor fluorescente e exibem morfologia mitocondrial normal. </li></ol> 2. Crescimento das células e preparação para a imagem A função celular e da resposta ao tratamento com medicamentos são altamente dependentes da densidade da célula e actividade metabólica. Os melhores resultados são obtidos quando as célulasestão dividindo activamente (fase mid-log, ~ 0,5-1 x 10 7 células / ml). A maneira mais fiável para gerar culturas de densidade consistente de fase mid-log é para inocular de uma pré-cultura em fase estacionária. <ol><li> Prepare uma pré-cultura estacionária-fase: escolher uma única colônia de células transformadas a partir de uma placa e inocular meios líquidos seletivos (5 ml em um tubo de 50 ml cônico-bottom). Crescer a 30 ° C com agitação a 225 rpm até a densidade óptica da cultura a 600 nm (OD 600) atingiu um patamar (24-48 h). </li><li> Prepare uma cultura fase mid-log para a observação: use o volume adequado de pré-cultura para inocular 5 ml de meios seletivos em um tubo de 50 ml cônico-bottom. Meios YPD é autofluorescente e não devem ser utilizados para estes estudos. Use, glicose base, abandono (SC-Ura) media completos sintéticos. Crescer as células a 30 ° C, agitação a 225 rpm, durante 4-16 horas, até que eles atinjam fase mid-log (~ 0,5-1 x 10 7 células / ml). A densidade celular pode ser determinadamedindo a OD 600; calibrar o espectrofotómetro para determinar a leitura de OD 600 correcto. No nosso Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), a fase semi-log corresponde a uma DO 600 de 0,1-0,3. </li></ol> Mito-roGFP1 detecta flutuações no organelo em resposta a alterações metabólicas. Por exemplo, neste ensaio mitocondriais alterações de estado redox quando a levedura crescer em fontes de carbono fermentável (por exemplo, glucose, como em meio SC) em função das fontes de carbono não fermentáveis ​​(por exemplo, glicerol, tal como em meios SGlyc), e mesmo em diferentes lotes da mesma mídia. Consequentemente, a utilização do mesmo lote de meios para todas as experiências. <ol start="3"><li> Células estão prontas para a concentração (veja o passo 2.4) e imagem se nenhum tratamento está sendo realizado. Se as células estão a ser tratados, incubar as células com o tratamento adequado e continuar para a próxima etapa. </li><li> Concentre-se 1 ml de cultura por centrifugação a 6000 xg durante 15 seg eressuspensão do sedimento celular em 20 ul de meio. Estas condições de maximizar o número de células distintas no campo de visão. </li><li> Aplicar 2 ul das células ressuspensas para uma lâmina. Cobrir com uma lamela (n º 1.5, de preferência de alto desempenho 170 ± 5 m de espessura) e selar as bordas da lamínula com claro unha polonês ou valap (ver Reagentes). Para selar com valap, derreter uma pequena quantidade de uma espátula de metal, mantendo-a sobre uma chama de bico de Bunsen, em seguida, espalhar uma pequena quantidade ao longo das arestas da lamela. </li><li> Manter as células a 30 ° C durante a imagiologia. Um aquecedor objectiva sobre a lente de imersão em óleo 100x usado para geração de imagens funciona bem para esta aplicação. Sob estas condições, a morfologia mitocondrial, estado redox, e os níveis de ATP permanecem inalterados durante a imagem durante 10-15 min. </li></ol> 3. Configuração de imagem <ol><li> Configuração para imagens mito-roGFP1 em um microscópio de fluorescência de campo amplo Os passos aqui são adaptados para o AxioObserver.Z1 microscópio equipado com um LED fonte de excitação Colibri, um amplo campo de Orca ER câmera e software de aquisição Axiovision. Fotodegradação dos dois canais e fotoconversão de oxidados mito-roGFP1 é significativamente reduzido com uma iluminação LED em comparação com arco iluminação da lâmpada de mercúrio (veja abaixo). Para maximizar o sinal e resolução, usar a maior abertura numérica possível no objetivo, eo menor ampliação que fornece resolução espacial suficiente. Além disso, para imagiologia de mito-roGFP, verificar que o objectivo transmite bem a 365 nm. O 100x/1.3NA PlanNeofluar objetivo CE (Zeiss) funciona bem para esta aplicação. Configure o software de aquisição para capturar as espécies mito-roGFP1 oxidadas e reduzidas. Usamos as seguintes condições. <ol><li> Configure o canal de oxidado mito-roGFP usar excitação em 365 nm (100% LED de alimentação) e um filtro de emissão adequada para GFP, como o 38 HE filtrar set (Zeiss), com o excitatio incluídon filtro removido do cubo. A remoção do filtro de excitação permite excitação a 365 nm, ambas e 470 nm, sem a necessidade de mudar os filtros, aumentando assim a resolução de tempo possível. </li><li> Configurar o canal para a redução de mito-roGFP utilizar a excitação a 470 nm (100% da potência do LED) e, como mencionado acima, o mesmo cubo de filtro de emissão usado para a oxidação de mito-roGFP. Defina a câmara para 1x1 binning para otimizar resolução espacial. </li><li> Definir software para adquirir pilha az composto por 11 fatias com 0,5 mM espaçamento, coletando os dois canais em cada posição z. Este modo de aquisição é mais lenta do que a aquisição de cada pilha por sua vez, z, mas evita que o movimento de artefactos decorrentes mitocondrial entre a aquisição dos canais oxidados e reduzidos. </li><li> Imagem de várias células para determinar um tempo de exposição apropriado, produzindo um sinal forte, mas não de saturação. É importante manter a relação dos tempos de exposição para oxidada e reduzida de mito-roGFP1 para todos experimentos. Por exemplo, se os tempos de exposição para oxidada e reduzida de mito-roGFP1 são de 300 e 100 ms, respectivamente, então o tempo de exposição para oxidada Mito-roGFP1 deve ser de 3 vezes maior que para a redução de mito-roGFP para todas as experiências. </li></ol></li><li> Configuração para imagens mitGO-ATeam2 em um microscópio confocal espectral Para quantificar os níveis de ATP, utilizando mitGO-ATeam2, a fluorescência da GFP (máximos de emissão 510 nm) deve ser diferenciado de que a partir de OFP (emissão máxima de 560 nm). Há conjuntos de filtros de fluorescência que resolvem a fluorescência emitida a partir destes fluoróforos. No entanto, descobrimos que um detector espectral, disponível em microscópios de varredura confocal muitos laser, funciona melhor para esta aplicação. Um detector espectral separa a emissão de fluorescência em diversos componentes (normalmente 32 ou mais) com base no comprimento de onda. Várias bandas de comprimentos de onda adjacentes, podem ser combinados em um canal de imagem. Os comprimentos de onda a serem combinados são seleccionadas empiricamente de modo a maximizar o sinal de GFP e OFP, evitando cruzamento de sinal que iria confundir o traste medição. Utilizar a abertura numérica da lente mais elevada disponível. Nós usamos um 100x/1.49 ou 60x/1.49 lente Apo-TIRF. Usamos a Nikon A1R microscópio confocal executando o software NIS Elements. Configure o software de aquisição para capturar as espécies mitGO-ATeam2 ATP-bound e ATP-desacoplado. Usamos as seguintes condições. <ol><li> Definir pinhole de 1,0 unidades de Airy (UA), que no nosso sistema corresponde a resolução az de cerca de 0,42 mM. </li><li> Definir zoom digitalização para se aproximar do limite de amostragem de Nyquist, que irá maximizar a informação espacial na imagem. No nosso sistema o tamanho do pixel é de 0,12 um. </li><li> Como as mitocôndrias podem se mover durante o exame, pode ser útil para aumentar a velocidade de imagem, cortando o campo para 512 x 256 pixels. O tempo total requerido para a imagem de uma estrutura do nosso sistema, é de 1,0 segundos, incluindo uma média de varredura de 2 vezes. Dependendo da resolução espacial desejado, o campo pode ser posteriormente cortada para crese resolução de tempo. </li><li> Excite a 488 nm, e recolher emissão de 500-520 nm para GFP e 550-580 nm para OFP. Valores ideais reais podem variar de acordo com as características do sistema de imagem. </li><li> A potência do laser óptima para o nosso sistema situa-se entre 6,0 e 6,4%. A potência do laser óptima irá variar para cada sistema de microscópio, mas irá ser idealmente tão baixa quanto possível e ainda produzir uma imagem interpretável. Use um medidor de energia interna ou externa para monitorar mudanças na potência do laser, que ocorrem normalmente ao longo do tempo, em qualquer sistema óptico. </li><li> Ajuste o ganho do detector de intensidade de luz e iluminação para maximizar a gama de valores de pixel detectada mas evitar a saturação do sinal, para o maior número possível de células. Não analise todas as células que contenham mais de 1% pixels saturadas. Imagem todas as amostras utilizando o mesmo objectivo, a potência do laser, digitalização de zoom, tamanho do pixel, ganho e offset. </li></ol></li></ol> 4. Aquisição de Imagem <ol><li> Localize o pla focal<html> ne de células de interesse, utilizando luz transmitida para minimizar o branqueamento da sonda fluorescente. </li><li> Depois de localizar uma ou mais células de interesse, recolher um z-série, através de toda a espessura de uma célula típica (aprox. 7 mM), utilizando um tamanho de passo de 0,5 micron. </li><li> Imagem outras células de interesse no slide, mas não uma imagem de único slide por mais de 15 min. Depois de 15 minutos sobre a lâmina, as células perdem a viabilidade. </li></ol> 5. Análise Nível de ATP mitocondrial é determinada pela medição da proporção da emissão mitGO-ATeam2 a 560 nm a 510 nm em que 27 O estado redox do organelo é medida como a redução de oxidação (R / S) rácio de mito-roGFP,. Isto emissão a 510 nm a excitação a 470 nm dividido pela emissão a 510 nm a excitação a 365 nm. Antes de calcular a razão, nós subtrair fundo e determinar um valor limiar para os pixels que pertencem ao mitocôndrias fluorescente. tenda &quot;&gt; domínio público (por exemplo, ImageJ 30) ou comercialmente disponíveis (por exemplo Volocity, Perkin-Elmer) de software pode ser utilizado para a análise de mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam2. Dependendo do software utilizado para a aquisição de imagens e para a análise, as imagens pode necessitar primeiro de ser convertido num outro formato, como TIFF, antes de abri-los no software de análise. Se as imagens são convertidas, é essencial para verificar que os valores de pixel não são mudadas durante a conversão. Análise de MITO-roGFP1 dados, usando ambos os programas é descrito abaixo. menus programa e as opções para selecionar dentro de cada menu são destacadas em negrito e itálico. 5.1 análise ImageJ <ol><li> Imagens abertas e tipo de alteração para 32 bit: Imagem → Tipo → 32 bits. </li><li> Desenhe uma região de interesse (ROI) em uma área onde não há células. Calcule a intensidade média nesta ROI: Analisar → Measure. </li><li> Subtrair o fundo média calculada a partir da pilha: Processo → Matemática → subtrair. </li><li> Usando o z-stack subtraídos, encontrar a fatia média e limiar em mitocôndrias: Imagem → Ajuste → Threshold e clique em Aplicar na janela do Threshold. Aplicar a todas as fatias na pilha. Verifique Definir fundo pixels de NaN. </li><li> Criar a relação z pilha: Processo → Image Calculator Divida a pilha reduzida pela pilha z oxidado para análise mito-roGFP1. Divida a imagem 560 nm (ATP bound) pelos 510 nm imagem (ATP não ligada) para análise mitGO-ATeam2. </li><li> Desenhe um ROI em torno da área de interesse. Escolha Analisar → Ferramentas → ROI Manager, e clique em Adicionar para registrar o ROI. Múltiplas regiões podem ser armazenadas no gestor. Em ROI Manager, selecione todos ROIs, em seguida, escolha Mminério → Multi-Measure para medir todas as fatias de pilha. Exportar dados para uma planilha para análise. </li></ol> 5.2 análise Volocity <ol><li> Importar imagens em uma biblioteca Volocity e criar uma sequência de imagens com 2 canais. </li><li> Desenhe uma região de interesse (ROI) em uma área onde não há células. Escolha: Tools → Ratio. </li><li> Use Volocity para calcular o background: Obter do ROI. </li><li> Ajustar o limiar para incluir estruturas mitocondriais. </li><li> Marque a opção de aplicar uma LUT arco-íris para o canal de relação. O canal de intensidade modulada pode produzir uma imagem menos barulhenta para apresen-tação, mas não deve ser usado para a quantificação da proporção média. </li><li> Selecione a guia de medição, selecione o canal de relação e desenhar um ROI em torno da área de interesse. Meça o canal de relação, excluindo os valores zero. Múltiplas regiões podem ser seleccionados e mediuao mesmo tempo. Exportar dados para uma planilha para análise. </li></ol>

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	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui, descrevemos métodos para usar mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 como biossensores para avaliar o estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em células de levedura viva. Nós achamos que a expressão de plasmídeo de origem mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam resulta em quantitativo direcionamento para mitocôndria, sem qualquer efeito óbvio sobre a morfologia e distribuição mitocondrial ou nas taxas de crescimento celular. 3 Mito-roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial de altamente oxidad...

As mitocôndrias são organelos essenciais para a produção de ATP, a biossíntese de aminoácidos, ácidos gordos, heme, aglomerados de enxofre do ferro e pirimidinas. As mitocôndrias também desempenham um papel fundamental na homeostase do cálcio e na regulação da apoptose. Uma crescente evidência de ligações mitocôndrias ao envelhecimento e doenças relacionadas à idade, incluindo a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e doença de Huntington. 2 Enquanto as pessoas vivem suas vidas inteiras com mutações em proteínas mitocondriais que estão associadas a doenças neurodegenerativas, os sintomas da doença ocorrerem apenas mais tarde na vida. Isto indica que as mudanças ocorrem nas mitocôndrias com a idade, que permitem a patologia a emergir. De fato, aptidão mitocondrial está relacionada com a saúde geral e longevidade celular em leveduras e células de mamíferos 3,4 Aqui., Descrevemos como usar geneticamente codificados, biossensores fluorescentes raciométrica para avaliar dois aspectos críticos do mitochondria em células de levedura viva: o estado redox e os níveis de ATP. Função mitocondrial na mobilização de energia aeróbica está bem estabelecida. Estado redox mitocondrial é um produto da redução e espécies oxidantes na organela, inclusive NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutationa / glutationa oxidada (GSH / GSSG) e espécies reativas de oxigênio (ROS). Desacoplamento mitocondrial ou hipóxia afeta a atividade respiratória mitocondrial e altera a relação de NAD + para NADH na organela. ROS, que são produzidos a partir de transferência de electrões entre ineficiente complexos da cadeia de transporte de electrões na membrana mitocondrial interna, bem como a partir da desaminação de aminas através da monoamina oxidase na membrana mitocondrial externa 5, lípidos, proteínas, danos e ácidos nucleicos e têm foi associada ao envelhecimento e as doenças neurodegenerativas associadas à idade 6,7,8. ROS também desempenhar um papel na transdução de sinal em mitochondria, através da oxidação de GSH. Por exemplo, NADH desidrogenase não só contribui para a produção de ROS, mas também é regulada através de interações com o pool de glutationa 9,10. desidrogenase α-cetoglutarato e aconitase, componentes do ciclo do TCA, exibem uma actividade reduzida em ambientes oxidantes 11,12. Na verdade, a regulação redox dependente da atividade aconitase é conservada de bactérias a mamíferos 13,14. Assim, o monitoramento do estado redox e os níveis de ATP das mitocôndrias é crucial para entender sua função e papel na patologia da doença. Métodos bioquímicos têm sido usados ​​para avaliar o estado redox, ou os níveis de ATP de células inteiras ou mitocôndrias isoladas. Métodos amplamente utilizadas para avaliar o estado redox de células inteiras ou mitocôndrias isoladas são baseadas na medição dos níveis do par redox de GSH / GSSG 15. O sistema luciferina-luciferase é comumente usado para medir mitocondrialEm ambos os níveis de ATP de células inteiras permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. 16,17,18,19,20 Neste ensaio, liga-se a luciferase de ATP e catalisa a oxidação da luciferina e de quimioluminescência. 21 A intensidade da luz emitida é proporcional à quantidade de ATP na mistura reaccional 22. Estes métodos têm revelado informação fundamental em relação a função mitocondrial, incluindo a descoberta de que os pacientes com doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, têm níveis anormalmente baixos de ATP 23. No entanto, eles não podem ser utilizados para a imagem de vida, as células intactas. Além disso, os métodos baseados na análise de célula completa fornecer uma média de estado redox, ou os níveis de ATP em todos os compartimentos da célula. Medidas em organelas isoladas são potencialmente problemático porque o estado redox mitocondrial ou níveis de ATP podem mudar durante o fracionamento subcelular. Finalmente, estudos recentes do nosso laboratório e outros indicam quemitocôndrias dentro das células individuais são heterogêneos em função, que por sua vez afeta a vida útil das células-mãe e filha. 3 Assim, há uma necessidade de medir os níveis de ATP mitocondrial e estado redox em células vivas com resolução subcelular. Os biossensores para a função mitocondrial descrita aqui são ambos baseados em boas práticas agrícolas. GFP Redox-sensível (roGFP) 24,25 é uma variante da GFP em que superfície expostas cisteínas são adicionados à molécula. roGFP, como a GFP do tipo selvagem, que apresenta dois picos de excitação (em ~ 400 nm e ~ 480 nm) e um pico de emissão a 510 nm ~. A oxidação dos resíduos de cisteína em roGFP resulta em um aumento na absorção a 400 nm, ~. Redução dos cisteínas favorece excitação a 480 nm, ~. Assim, a razão de emissão de 510 nm após excitação de roGFP em 480 nm e 400 nm, revela a quantidade relativa de roGFP reduzida e oxidada, o que reflecte o estado redox do meio ambiente do fluoróforo. Duas versiões de roGFP são amplamente utilizados: roGFP1 e roGFP2. Ambos contêm as mesmas inserções de cisteína. roGFP1 baseia-se na GFP do tipo selvagem e roGFP2 baseia-S65T GFP, que tem mais eficiente excitação a 480 nm e menos eficiente de excitação a 400 nm em comparação com wtGFP 24. roGFP1 é menos sensível do que o pH roGFP2 e a sua gama dinâmica estende ainda mais para o intervalo reduzido. Assim, roGFP1 pode ser mais útil para o monitoramento mais reduzindo compartimentos tais como mitocôndrias ou citosol, e compartimentos com pH variável, como endossomos. roGFP2 oferece sinal brilhante e, em alguns estudos, uma maior gama dinâmica do que roGFP1 24,26. Estudos em Arabidopsis thaliana indicam que o tempo necessário para responder a alterações no estado redox é similar para ambos os sensores (t ½ para oxidação, 65 e 95 s e t ½ para redução, 272 e 206 segundos, o que roGFP1 e roGFP2, respectivamente) 26. MitGO-ATeam2 é minimamente invasivo, confiávelsensor que mede ATP mitocondrial no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) de sonda, que consiste na subunidade da ε o F F 1-ATP sintase ensanduichada entre dador FRET e proteínas aceitadoras fluorescentes GFP (proteína fluorescente e laranja (OFP), respectivamente), 27. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador FRET em estreita proximidade com o receptor e para permitir a transferência de energia entre o dador eo aceitador. Existem duas variantes da GO-ATeam, GO-ATeam1 e GO-ATeam2. GO-ATeam2 tem uma maior afinidade para MgATP que GO-ATeam1, tornando-o mais adequado para medir o tipicamente inferior [ATP], em comparação com as mitocôndrias do citosol 27. Para sondar estado redox mitocondrial, construiu-se uma proteína de fusão (mito-roGFP1) consistindo de roGFP1 fundido com a sequência líder de um ATP9nd expresso a partir de um centrómero baseado (baixo número de cópias) o plasmídeo de expressão de levedura sob o controlo do forte desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Usamos roGFP1 para sondar o estado redox de mitocôndrias no contexto do envelhecimento do modelo fungo Saccharomyces cerevisiae. Descobrimos que roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial que ocorrem durante o envelhecimento e em resposta a disponibilidade de nutrientes, mas não tem nenhum efeito prejudicial aparente em células de levedura. Vemos também a variabilidade no estado redox de mitocôndrias nas células de leveduras vivas individuais, o que reafirma a importância de um biosensor com resolução espacial subcelular. MitGO-ATeam2 é uma variante da GO-ATeam2, que tem a sequência de sinal mitocondrial do citocromo c oxidase subunidade VIII inserido no terminal amino da GO-ATeam2 27. Nós modificamos o mitGO-ATeam2 sonda (gentilmente cedido pelo laboratório de H. Noji, o Institutof Scientific e Industrial Research, Universidade de Osaka, Japão), para utilização em levedura por subclonagem-lo, através de Xba1 e locais HindIII, no vector de expressão de levedura pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, EUA), que é um plasmídeo de cópia de baixa contendo o promotor GPD constitutivo forte. Expressamos mitGO-ATeam2 em levedura de brotamento, e encontrar, pela coloração de contraste com o DNA-binding corante DAPI, que localiza exclusivamente para a mitocôndria, onde ele serve como uma sonda eficaz para medir as mudanças fisiológicas em níveis de ATP mitocondrial. roGFP e GO-ATeam ambos são geneticamente codificado. Como resultado, eles podem ser introduzidos e mantidos de forma estável em células intactas, e fornecem informações sobre o estado redox, ou os níveis de ATP, em células vivas individuais. Além disso, ambos os biossensores monitorar as alterações no estado redox ou níveis de ATP que ocorrem sob condições fisiológicas. 28 Ambas as sondas são também raciométrica. Como resultado, as medições feitas com estes testes não são afetados por changes na concentração biosensor ou iluminação da amostra ou espessura. Finalmente, ambos os biossensores fornecer resolução espacial subcelular. Com efeito, roGFP foi orientada de mitocôndrias, ER, endossomas e peroxissomas 24, e pode detectar alterações no estado redox de cada um destes organelos, em grande parte independentes do pH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

As mitocôndrias têm um papel em muitos processos celulares, a partir do metabolismo da energia e homeostase do cálcio para controlar o tempo de vida de celular e morte celular programada. Esses processos afetam e são afetados pelo estado redox e de produção de ATP pela mitocôndria. Aqui, descrevemos o uso de dois, biossensores geneticamente codificados raciométrica que podem detectar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em resolução subcelular em células de levedura viva. Estado redox mitocondrial é medida usando Proteína Fluorescente Verde redox-sensível (roGFP) que é direcionado para a matriz mitocondrial. Mito-roGFP contém cisteínas nas posições 147 e 204 da GFP, que sofrem oxidação e redução reversível e dependente do ambiente, que por sua vez altera o espectro de excitação da proteína. MitGO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância Förster (FRET) sonda em que a subunidade ε da F o F 1 ATP sintase é imprensada entre FRET doador e receptor fluoproteínas rescent. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador e aceitador de FRET em estreita proximidade e permitir a transferência de energia de ressonância de fluorescência do dador ao receptor.

Medindo estado redox mitocondrial com mito-roGFP Aqui, mostramos que mito-roGFP1 tem a gama dinâmica para detectar alterações no estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reduzida em células de levedura viva, sem afetar o crescimento de células de levedura ou morfologia mitocondrial. Primeiro, encontramos células que expressam GFP mitocôndrias-alvo e roGFP1 crescer a taxas normais (Figura 1A). A taxa de crescimento máxima, tal como medido pelo declive máximo da...

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Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Descreve-se a utilização de dois raciométrica, biossensores codificados geneticamente, que são baseados em GFP, para monitorar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP na resolução subcelular em células vivas.

Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.9K visualizações.  Columbia University. Descreve-se a utilização de dois raciométrica, biossensores codificados geneticamente, que são baseados em GFP, para monitorar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP na resolução subcelular em células vivas.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Bioengenharia

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Imagem Lifetime fluorescência de rotores moleculares em células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Sensor de microagulhas baseado oco para Multiplexed Transdermal Eletroquímica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...