Agradecemos Eric Wieschaus, que forneceu a base sobre a qual este protocolo foi desenvolvido. Nosso trabalho é apoiado por uma Verna &amp; Marrs McLean Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular Start-up Award, Baylor College of Medicine.

1. Montar Copas de colheita de embriões <ol><li> Corte fora o fundo de um copo 100 mL Tri-milho, com uma lâmina de barbear, tornando a borda mais suave possível. Os copos são mais fáceis de lidar se você também aparar as três cantos fora do topo, embora isso não seja absolutamente necessário. </li><li> Corte um quadrado de tela de arame (6 cm x 6 cm). Em um prato pré-aquecido quente, dentro de uma camada de fumaça capô, a praça de malha de arame em cima de um pedaço de pesados ​​folha de alumínio. Empurre a borda inferior do corte do copo firmemente na malha quente. Aguarde alguns segundos e levantar a taça com a malha agora anexado. Se a folha também varas, apenas retire-a. </li><li> Resfriar o copo durante a noite. Retire o excesso com uma tesoura de malha, e areia de desconto em qualquer arestas com uma lixa de grão fino. </li></ol> 2. Faça placas de Agar Suco de Maçã <ol><li> Num balão 6L, combine BD 100 g Agar Bacto e água destilada 3L. Autoclave do ágar por 30 minutos na configuração de escape lento. </li><li> Num balão 2L com uma barra de agitação, combine 100 g de sacarose, 1L de suco de maçã, e 6 g de ácido p-hidroxibenzóico. Aquecer a solução à ebulição, agitando em um prato quente. Não deixe ferver por mais 2 minutos. Permitir a mistura de suco de maçã para esfriar e adicione com barra de agitação para o agar. Misturar completamente. </li><li> Permitir que a solução combinada para esfriar em banho-maria a 60 ° C antes de verter em 60x15 milímetros pratos petri. Alternativamente, uma bomba peristáltica pode ser usada para dispensar o ágar. Permitir que as placas para esfriar a temperatura ambiente por pelo menos 4 horas. Pilha em Rubbermaid recipientes com uma camada de papel toalha molhada e armazenar a 4 ° C. </li></ol> Notas: <ul><li> No outono ou no inverno, pode ser necessário adicionar um adicional de 100 mL de água para o ágar. </li><li> A marca de placas de Petri é importante! Apenas os pratos BD Falcon encaixar os copos Tri-milho. Informações sobre pedidos específicos podem ser encontrados na tabela de Materiais abaixo. </li></ul> 3. Adicionar Flies GFP para as Copas de colheita de embriões <ol><li> Expandir ações GFP de acordo com as suas necessidades de coleta através da criação de garrafas de moscas cerca de duas semanas antes da imagem. Um frasco de moscas geralmente é mais do que suficiente para encher um copo de colheita de embriões com um mínimo de 50 fêmeas e 30 machos. Para melhor postura, moscas devem ser recém-eclosed (ou seja, menos de 5 dias pós-eclosão). </li><li> Faça uma levedura colar enchendo um copo pequeno, com partes iguais Red Star fermento biológico seco e água destilada, e mexa até que o fermento é dissolvido. A pasta deve aproximar a consistência de manteiga de amendoim molhado. Mais fermento ou água pode ser adicionada para alterar a consistência. Colar de levedura pode ser usada por vários dias, e deve ser armazenado, coberto, a 4 ° C. </li><li> Depois que o colar fermento está pronto, retire as placas de suco de maçã de 4 ° C de armazenamento. Streak a maçã suco de placas com a pasta de levedura, e permitir-lhes para aquecer a 22-25 ° C, o que incentivará postura. </li><li> Dobre um papel de filtro circular no meio, depois ao meio novamente. Guarnição para 8-9 cm de diâmetro, e fazer as dobras de acordeão no quarto de círculo. Desdobrar o círculo, invertê-lo, e insira-o em um copo de coleta até tocar na malha. Certifique-se que o papel está seguro no copo para que ela não cair e esmagar as moscas. O papel de filtro é opcional, mas fornece um ambiente acolhedor para o acasalamento, e mantém a umidade no copo. </li><li> Etiqueta com o nome de um copo de ações e data. Transferência das moscas da garrafa para o copo de coleta agitando a garrafa invertida sobre o cálice, e cobrir imediatamente o copo com um prato preparado suco de maçã. Fixe a placa para o copo com um elástico. Conjunto de copos de lado malha para cima em uma área com luz direta. Certifique-se que nenhuma sombra cair sobre o copo, como as moscas não estava bem no escuro. </li><li> Mudar a placa de suco de maçã, se necessário. Duas horas de colecções, à temperatura ambiente, funcionam bem para celularização imagem. </li></ol> 4. Prepare uma Câmara de montagem <ol><li> Para preparar uma câmara de montagem para os embriões, corte um pedaço de fita dupla face 2-3 cm de comprimento e coloque-o em um slide, alinhando o eixo longitudinal da fita e slides. Corte um segundo 2-3 cm longo pedaço de fita dupla face e camada em cima do outro pedaço de fita, certificando-se de suas bordas estão alinhadas. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, fazer dois cortes de aproximadamente 3 mm no centro da fita e perpendicular ao longo eixo da lâmina. Remova a fita entre os cortes para fazer um canal. Pipeta uma gota de óleo Halocarbon 27 para o canal. Este canal é onde os embriões serão montadas. </li></ol> Notas: <ul><li> Somente o ½ polegada Scotch fita dupla face é a espessura certa para acomodar os embriões. </li><li> Oil Halocarbon 27 é oxigênio permeável, e assim permite a troca de oxigénio, evitando a desidratação do embrião. Devido ao seu índice de refração, Halocarbon Oil 27 é também ideal para o estadiamentoe imagem embriões. </li></ul> 5. Embriões Dechorionate <ol><li> Para coletar e embriões dechorionate, despeje o suficiente lixívia 50% para a placa de ágar suco de maçã para submergir completamente toda a superfície. Usando um microscópio de dissecação, como o Discovery Zeiss V8 com luz transmitida, para assistir os embriões para liberação dos seus córion. Assim que o córion solta e libera a partir de alguns embriões (30-60 segundos), despeje água sanitária e embriões em um coador de celular. </li><li> Lavar embriões no filtro imediatamente e vigorosamente com água destilada a partir de uma garrafa de esguicho. Dab filtro em papel toalha. Se qualquer rosa é visto na toalha após dabbing, continue lavando os embriões com água. </li><li> Use um pincel úmido para transferência de embriões 10-50 para um prato limpo suco de maçã (sem colar levedura). Pavio fora da água com a borda rasgada de uma toalha de papel e cobrir imediatamente os embriões com uma pequena quantidade de óleo Halocarbon 27. </li></ol> Notas: <ul><li> Não use água sanitária Clorox. Em vez disso, use uma marca, como Bleach Austin A-1 comercial, que é &lt;hipoclorito de sódio a 6%. </li><li> Excesso de branqueamento ou lavagem insuficiente resultará em embriões com mushy celularização irregular. </li></ul> 6. Embriões palco e Monte <ol><li> Usando o microscópio de dissecação com luz transmitida, siga as orientações morfológicas de 20 a Bownes estágio embriões no prato. Utilizando uma pinça, a transferência de 5 mitótica ciclo de 11 ou 12 embriões, correspondendo a Bownes estágio 4, para o canal da câmara de montagem. Organizar embriões em uma linha, com os lados dorsal e ventral lado visível e lateral para baixo. Embriões são facilmente dispostos em esta orientação em petróleo sozinho. Não embriões multidão em conjunto, como eles vão privar os seus vizinhos de oxigênio uma vez que a lamínula é aplicado abaixo. (Deixar aproximadamente metade de um comprimento de embriões entre eles). </li><li> Lay uma borda de uma tampa de 25x25 milímetros deslizar sobre a fita dupla face em um lado do canal. Soltar o deslizamento de capa a capa do canal. Se o ar é pego por baixo, aplique uma pequena quantidade de óleo Halocarbon 27 na borda da lamínula. Ação capilar vai puxar o óleo no canal e empurrar para fora do ar. </li></ol> Notas: <ul><li> Outro recurso excelente para os embriões de preparo é o seguinte: Campos-Ortega, JA e Hartenstein, V. (1985). O desenvolvimento embrionário de Drosophila melanogaster. Springer-Verlag, de Berlim. Embora este livro não é mais publicado, cópias usadas são regularmente disponíveis no Amazon.com. </li><li> Sempre usar o Halocarbon 27 Oil com moderação. Isso fará com que a montagem mais fácil. Ele também irá prevenir acidentais oozing do óleo para a objetiva do microscópio nas etapas seguintes de imagem. </li></ul> 7. Embriões imagem <ol><li> Como você continuar aqui, naturalmente, ser ditada pela mudança a forma da célula que você é imagem, ea pergunta que você está abordando. Para qualquer mudança de forma, coloque a sua câmara de montagem de cada um microscópio vertical ou invertida, encontrar o seu embriões por luz transmitida, e depois mudar para imagem confocal se concentrar em uma região de interesse. Aderir às melhores práticas para microscopia confocal, tais como os discutidos na MicroscopyU Nikon ( <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">http://www.microscopyu.com/articles/confocal</a> ). Ser particularmente rigoroso em embriões expondo sua vida como potência do laser menos possível, para evitar fotobranqueamento e fototoxicidade. </li><li> Para celularização, nós imagem em um microscópio a laser 710 confocal Zeiss, usando um C-Apochromat 40x/1.2 W objetivo Corr. Este microscópio é instalado numa sala com temperatura controlada, com temperaturas variando entre 18-20 ° C. Enquanto o controle de temperatura não é absolutamente necessário, é melhor para o microscópio e torna a imagem mais consistente. Nós imagem regularmente em um único plano, perto do meio do embrião, a seguir a invaginações da membrana plasmática em secção transversal (Figura 2). Para simplesmente seguindo a dinâmica invaginação, 30-60 segundos de intervalo são suficientes para lapso de tempo de imagem, e os embriões devem suportar imagem para&gt; 90 minutos sem sinais óbvios de privação de oxigênio. </li><li> Depois de adquirir as imagens, eles podem ser analisados ​​usando qualquer número de pacotes de análise de imagem, incluindo freeware dos Institutos Nacionais de Saúde, chamado ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a> ). Os dados podem ser apresentados como filmes (Movie 1), seqüências (Figura 2), ou kymographs 21. </li></ol> Nota: <ul><li> A água de imersão C Apochromat-40x/1.2 W Corr objetivo é bem adequada para imagens perto do embrião mid-section, devido à sua abertura, o que limita as aberrações para imagens de tecidos profundos em amostras aquosas, e dá alta resolução e alto sinal fluorescente. Além disso, este objectivotem uma distância muito longa de trabalho (220 mm). No entanto, os objectivos de imersão outras de água ou glicerina terá um bom desempenho, principalmente se a mudança de forma de células de interesse podem ser fotografada perto da superfície do embrião. </li></ul> 8. Método Alternativo: Embriões Monte com a &quot;cola-embrião&quot; <ol><li> Para a imagem mudar de forma uma célula que não celularização, pode ser necessário montar embriões em uma orientação específica que não é facilmente mantidos em petróleo sozinho. Para fazer isso, use um método alternativo de montagem ao descrito anteriormente. Comece por fazer &quot;embrião-cola&quot;, combinando 20 cm de fita dupla-face com 250 mL de heptano em frasco de cintilação. Coloque o frasco de cintilação em um nutator ou plataforma rotativa, e misture durante a noite. </li><li> Mergulhe uma ponteira amarela na cola do embrião, e então traçar a ponta ao longo de um slide, deixando um rastro de cola. Enquanto o heptano está evaporando, alinhar a sua encenado embriões na orientação necessária em um bloco de ágar. (Lembre-se que a superfície do embrião a ser trabalhada deve estar voltado para o ágar. Por exemplo, para a imagem mudar a forma da célula durante a formação do sulco ventral, montagem embriões com o seu lado ventral de frente para o ágar). </li><li> Inverter o slide com cola, e pressione suavemente a trilha de cola contra os embriões no bloco de ágar. Agora inverta a lâmina novamente. Os embriões vai ser preso na orientação adequada. Adicionar duas camadas de fita dupla face em ambos os lados dos embriões, cobri-los com óleo Halocarbon 27, e aplicar uma lamela. Prosseguir com a imagem, como descrito acima. </li></ol> 9. Resultados representativos: Se os embriões são saudáveis ​​ea imagem é ótima, então celularização deve tomar 50-60 minutos, e as invaginações da membrana plasmática deve ingresso quase 40 microns. No entanto, se os embriões são over-branqueada de oxigênio, privado ou danificado por fototoxicidade, então invaginação será lento ou parar, em particular na área trabalhada. Tal deterioração da saúde do embrião muitas vezes resulta em desenvolvimento alteradas, e um fracasso para eclodir as larvas. Assim, por um rigoroso teste para a saúde do embrião após ensaio de imagem, mantenha o seu slides em uma câmara úmida para incubação e assistir no dia seguinte. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fluxo de trabalho de colheita de embriões a imagem. O fluxo de trabalho do protocolo pode ser dividido em quatro fases principais. Na primeira fase, todos os suprimentos e componentes individuais estão preparados, e em seguida voa o copo de colheita de embriões, maçã placa de ágar suco e GFP são colocados juntos para criar o ambiente embrião-laying. Na segunda fase, os ovos e embriões que são colocadas nas placas de ágar suco de maçã são coletados. Na terceira fase, os embriões são removidos da placa, encenado e transferidos para a câmara de montagem. Na quarta fase, os embriões montados são gravadas em um microscópio confocal. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Dados representativos de lapso de tempo de imagem de celularização. Embriões são montados com dorsal (D) e ventral (V) os lados claramente visível, e são gravadas perto de seu meio para seguir as invaginações da membrana plasmática no cross-section. O embrião mostrado aqui expressa uma GFP-Miosina-2 sonda 6, que se concentra nas pontas das invaginações da membrana plasmática. Assim, acompanhando o ingresso desta frente ao longo do tempo dá a velocidade com que a membrana plasmática invagina. O ponto de tempo 0:00 minutos corresponde ao início celularização. Logo após o ponto de 56:00 minutos do tempo, a gastrulação inicia no lado ventral do embrião. Bar é de 40 microns. Filme 1. Representante do filme de lapso de tempo de imagem de celularização. Este filme corresponde a Figura 2. Para gravar todo o processo de celularização, imagem iniciados no ciclo mitótico, antes 13, a captura de regressão sulco pseudocleavage, e continuou até a gastrulação movimentos foram vistos no lado ventral do embrião. As imagens foram coletadas em intervalos de um minuto. As intensidades foram aumentadas pós-aquisição para torná-lo mais fácil ver os movimentos gastrulação. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">Clique aqui para filme</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Eventos de desenvolvimento e de tempo * </td><td> Célula muda de forma relacionada com </td><td> Um link para a doença ou a saúde humana </td><td> Referências recentes, com imagens ao vivo </td></tr><tr><td> Pseudo-clivagem formação de sulco (4; 90 minutos pf) </td><td> Citocinese </td><td> Poliploidia e câncer de progressão 1 </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 Cao et al., 2010 9 </td></tr><tr><td> Celularização (5; 130 pf minutos) </td><td> Citocinese </td><td> Poliploidia e câncer de progressão 1 </td><td> Cao et al., 2008 10 Sokac &amp; Wieschaus, 2008 11 </td></tr><tr><td> Formação de sulco ventral; invaginação Mesoderma (6; 180 minutos pf) </td><td> Constrição apical; transição epitelial-mesenquimal </td><td> Câncer de metástase 2 </td><td> Fox &amp; Peifer, 2007 12 Martin et al., 2009 13 </td></tr><tr><td> Extensão Germband (7; 195 pf minutos) </td><td> Extensão convergente </td><td> Defeitos do tubo neural 3 </td><td> Bertet et al., 2004 14 Blankenship et al., 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11; 320 pf minutos) </td><td> Formação do tubo epitelial e ramificação </td><td> Angiogênese 4 </td><td> Caussinus et al., 2008 16 Gervais &amp; Casanova, 2010 17 </td></tr><tr><td> Fechamento dorsal (14; 620 minutos pf) </td><td> Constrição apical </td><td> Cicatrização de feridas 5 </td><td> Gorfinkiel et al., 2009 18 Solon et al., 2009 19 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Exemplos de mudanças no formato da célula fotografada em embriões de mosca viva * O número Bownes estágio e do tempo pós-fertilização (PF), quando cada evento começa, são listados de acordo com Campos-Ortega, 1985. <table border="1"><tbody><tr><td> Fly estoque </td><td> Rótulos </td><td> Referência original </td></tr><tr><td> Spider-GFP (95-1) </td><td> Membrana plasmática </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille-GFP (117-2) </td><td> Membrana plasmática </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43-Vênus </td><td> Membrana plasmática </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 </td></tr><tr><td> Spaghetti Squash-GFP (Sqh-GFP) </td><td> Miosina-2 </td><td> Royou et al., 2002 6 </td></tr><tr><td> E-caderina-GFP (Ecad-GFP) </td><td> Junções célula-célula </td><td> Oda et al., 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP-Moesin </td><td> F-actina </td><td> Kiehart et al., 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrophin-Vênus (Venus-Utro) </td><td> F-actina </td><td> Sokac et al., Resultados não publicados </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Stocks úteis para imagens mudam de forma celular em embriões voar

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M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization.">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui descrito permitirá a criação de imagens, ao vivo confocal de uma série de mudanças no formato da célula do embrião voar em desenvolvimento. GFP ações para geração de imagens pode ser preparado por um laboratório individual (Tabela 2), mas muitas dessas populações também estão à disposição do público de centros como Bloomington Drosophila stock Centro da Universidade de Indiana ( <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> ) e Flytrap Centr...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>12-550-343</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips 25x25</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (Corning #2865-25)</td>
<td>1 2-524C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Squirt bottles (H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>02-897-11</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml Falcon tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD# 352070)</td>
<td>14-432-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bulbs for small pipets, 1 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>03-448-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scintillation vials with caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (Wheaton #986546)</td>
<td>66021-533</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tri-Corn Beakers, 100 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>60970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon Petri dish 60x15mm </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD# 351007)</td>
<td>08757 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD#352350)</td>
<td>08-771-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yellow pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ranin</td>
<td>L200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel mesh, 304, 12x24</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150-F-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass 5&frac34; inch Pasteur Pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>13-678-20B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P4 Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>09-803-6F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber bands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Max</td>
<td>A620645</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scotch double-sided tape, &frac12; inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Max</td>
<td>A8137DM-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jerry&#x2019;s Artarama</td>
<td>56460</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps High Precision Inox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>72701-DZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (BD #214010)</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H 8773</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Chemical/Fisher Scientific</td>
<td>H360-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (BD# 214010)</td>
<td>90000-760</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S7903</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p-Hydroxybenzoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H5501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red Star Active Dry Yeast</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LeSaffre</td>
<td>15700</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels, C-fold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kleenex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heavy duty aluminum foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reynolds Wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Austin&#x2019;s A-1 Commercial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100% Apple juice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Spray or Tree Top</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

imaging cell shape change in living drosophila embryos

O desenvolvimento de Drosophila melanogaster embrião passa por uma série de alterações nas células de forma que são altamente suscetíveis a viver de imagem confocal. Alterações nas células forma no fly são análogas àquelas em organismos superiores, e eles dirigem morfogênese do tecido. Assim, em muitos casos, seu estudo tem implicações diretas para a compreensão de doenças humanas (Tabela 1) 1-5. Na escala sub-celular, essas mudanças forma da célula são o produto de actividades que vão desde a expressão do gene de transdução de sinal, polaridade celular, a remodelação do citoesqueleto e do tráfico de membrana. Portanto, o embrião Drosophila fornece não só o contexto para avaliar mudanças no formato da célula como eles se relacionam com a morfogênese do tecido, mas também oferece um ambiente completamente fisiológica para estudar as atividades sub-celular que as células forma. O protocolo aqui descrito foi concebido para uma mudança de imagem forma específica de células chamado celularização. Celularização é um processo de crescimento dramático da membrana plasmática, e em última análise, converte o embrião sincicial no blastoderma celular. Ou seja, a interfase do ciclo mitótico 14, a membrana plasmática invagina simultaneamente em torno de cada um dos núcleos ~ 6000 corticalmente ancorado para gerar uma folha de células epiteliais primárias. Contador para sugestões anteriores, celularização não é impulsionado por Miosina-2 contratilidade 6, mas em vez disso é alimentado em grande parte por exocitose da membrana interna das lojas 7. Assim, celularização é um excelente sistema para estudar o tráfico de membrana celular durante as mudanças de forma que necessitam de invaginação da membrana plasmática ou de expansão, tais como citocinese ou transversal dos túbulos (túbulos T) morfogênese no músculo. Note que este protocolo é facilmente aplicado à imagem de outras alterações de células forma no embrião da mosca, e só requer pequenas adaptações, como mudar o estágio de colheita de embriões, ou usar &quot;cola embrião&quot; para montar o embrião de uma orientação específica (Tabela 1) 19/08. Em todos os casos, o fluxo de trabalho é basicamente o mesmo (Figura 1). Métodos padronizados para a clonagem ea transgenia Drosophila são usados ​​para preparar ações mosca de estábulo que expressam uma proteína de interesse, fundida a proteína verde fluorescente (GFP) ou suas variantes, e estas moscas fornecer uma fonte renovável de embriões. Alternativamente, as proteínas fluorescentes / sondas são introduzidas diretamente em embriões de voar através de injeção direta micro-técnicas 9-10. Então, dependendo do evento de desenvolvimento e mudança de células forma a ser trabalhada, os embriões são recolhidos e encenado pela morfologia em um microscópio de dissecação e, finalmente, posicionados e montados de lapso de tempo imagem em um microscópio confocal.

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Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Desenvolvimento precoce da mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é caracterizada por uma série de alterações nas células forma que são adequados para abordagens de imagem. Este artigo irá descrever as ferramentas básicas e métodos necessários para geração de imagens ao vivo confocal de embriões Drosophila, e incidirá sobre uma mudança a forma da célula chamada celularização.

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

14.2K visualizações.  Baylor College of Medicine (BCM). Desenvolvimento precoce da mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é caracterizada por uma série de alterações nas células forma que são adequados para abordagens de imagem. Este artigo irá descrever as ferramentas básicas e métodos necessários para geração de imagens ao vivo confocal de embriões Drosophila, e incidirá sobre uma mudança a forma da célula chamada celularização.

Vídeo: Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Methods Article

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões