Para configurar o novo sistema de cultura de fluxo multicanal sem bomba, depois de montar o módulo de reservatório de mídia ou MRM, insira os conjuntos de tubulação nele e coloque o MRM no aquecedor. Depois de fixar o aquecedor no lugar, proceda à inserção dos conjuntos da câmara de tecido ou TCAs no módulo da câmara de perfusão ou PCM. Usando a ferramenta de inserção de TCA, insira cada um dos oito TCAs, um de cada vez, nos orifícios do PCM.
Certifique-se de pressionar firmemente o adaptador com a ferramenta até que a parte superior da manga da tubulação ao redor de cada câmara toque a superfície circunscrevendo os orifícios no PCM. Separe o PCM parcialmente montado, juntamente com a cinta PCM e seis parafusos. 30 minutos após a montagem do compartimento e após o MRM atingir a temperatura desejada, usando uma pipeta de 50 mililitros, transfira o perfusato pré-equilibrado para a pastilha de MRM pré-aquecida, dispersando suavemente o líquido pelas laterais.
Em seguida, para colocar o PCM no MRM, insira os tubos de resistência do TCA que emanam do fundo do PCM nos insertos do MRM, quatro de cada lado do divisor MRM. Orientar o módulo de modo que as câmaras de tecido descansem contra o detector de oxigênio uma vez posicionado. Fixe o PCM na cinta de apoio usando seis parafusos e a chave de fenda elétrica.
Em seguida, fixe os TCAs dentro das aletas de suporte PCM usando a faixa elástica fornecida, esticando-a ao redor das aletas ao nível das juntas de borracha. Posicione o detector de oxigênio no suporte do detector, garantindo que sua face fique apoiada nas aletas PCM. Alinhe os pares do fotodetector LED com o corante sensível ao oxigênio nas câmaras de tecido, afrouxando os parafusos ajustados na lateral do suporte do detector e ajustando as guias laterais do detector, se necessário.
Por fim, coloque a tampa em cima do compartimento. Para carregar o tecido nas câmaras, aguarde até que o nível da mídia esteja a 0,5 centímetros do topo. Para carregar a retina colhida ou esclera de coroide RPE, usando pinças de ponta fina, coloque suavemente a retina sem dobrá-la em cada câmara.
Enquanto isso, use um lenço de papel para evitar que o líquido da câmara de tecido escorra para o sensor de oxigênio. Deixe o tecido afundar em direção e sobre o FRET. Para carregar as células de EPR nas membranas Transwell, depois de passar as células preparadas com EDTA de 0,25% de tripsina, semeá-las em filtros de polietileno tereftalato com tamanho de poro de 0,4 milímetro.
No dia do experimento, corte as membranas em três tiras de largura igual e carregue-as nas câmaras de tecido usando pinças. A Taxa de Consumo de Oxigênio, ou OCR, da retina foi constante durante o tempo em que os compostos de teste foram injetados, indicando saúde e função estáveis do tecido e apoiando a validade do método. Consistente com os dados obtidos usando os métodos convencionais de perfusão para retina e esclera coroide de EPR, a OCR diminuiu em resposta à oligomicina e aumentou em resposta à FCCP.
As alterações na taxa de produção de lactato ou RLF observadas foram inversas daquelas observadas para OCR. As células do EPR, que não foram previamente analisadas com sistemas de fluxo, responderam de forma semelhante à esclera da coroide do EPR usando este método.
