Agradecemos Steffen Koch por seu apoio técnico e Shannon Lee Layland (ambos Fraunhofer IGB Stuttgart) por suas sugestões úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo programa Atrair da Fraunhofer-Gesellschaft e do BMBF (tanto para KS-L.).

1. Preparação da amostra biológica <ol><li> Preparação de células vivas <ol><li> Preparação de células aderentes <ol><li> Sementes em células in vitro-cultivados ou recentemente isolado sobre um prato de fundo de vidro (Greiner BioOne / Alemanha) e incubar-los a 37 ° C e 5% de CO 2 até ligação de células é concluída. </li><li> Remover o meio de cultura e lavar suavemente três vezes com PBS antes de medição. Manter as células cobertas com PBS ou meio de cultura celular em todo o procedimento de medição todo. </li></ol></li><li> Preparação das células em suspensão <ol><li> Retire in vitro em cultura de células de acordo com protocolos comuns (por exemplo, tripsina-EDTA, raspagem célula), centrifugar as células e re-suspender o sedimento celular obtido em PBS ou meio de cultura celular. </li><li> Transferir 100 uL da suspensão de células (concentração: max. 100.000 células / ml) para um prato de fundo de vidro. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação de native tecidos <ol><li> Após a colheita dos tecidos, transferi-los para estéril, PBS gelado e mantê-los não mais do que 12 horas a 4 ° C, ou por medição gelo antes. As experiências anteriores demonstram que um tempo de armazenamento prolongado (tempo de isquemia fria de 12 horas a 4 ° C) resultou em alterações espectrais devido aos processos de degradação naturais. </li><li> As medições devem ser realizadas com o tecido coberto em PBS ou meio para evitar danos das proteínas de ECM e células devido a secagem dos tecidos. </li></ol></li></ol> 2. Raman Spectrometer O nosso espectrómetro de Raman personalizado combina um microscópio de fluorescência padrão (Olympus IX 71) com um espectrómetro de Raman, que permite a comparação directa das imagens de campo brilhante e fluorescência com os espectros de Raman. O conjunto de base até consiste de um 784 nm diodo laser (Toptica fotónica AG / Alemanha), um filtro de entalhe para a separação da luz Raman-dispersa a partir da luz de excitação, um microscópio umand a. espectrógrafo (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / EUA) com um dispositivo de carga acoplado (CCD da câmera) otimizado para a detecção de informação espectral (F-vista do Soft Systems imagem / Alemanha) 3. Controle da Função Laser <ol><li> Inicie o software Andor Solis (Andor / Reino Unido) e ajustar a temperatura da câmara CCD a -60 ° C para minimizar o ruído causado pelas correntes termicamente induzidas na câmara. </li><li> Colocar uma bolacha de silício sobre a platina do microscópio para o procedimento de calibração. </li><li> Ligar o laser e definir o poder de 85 mW. </li><li> Use o software Célula B (Olympus / Alemanha) para focalizar o laser sobre a bolacha até parece XY. </li><li> Medir a bolacha de silício com um tempo de integração única de 1 seg usando um objectivo ar 60x. </li><li> Alterar a unidade do eixo-x a partir do número de pixels para mudança de Raman (cm -1) no software Solis Andor. </li><li> Variar o foco do laser do pico de silício a 520 cm -1 emo espectro recolhido a fim de encontrar a intensidade máxima possível para esta banda Raman. A quantidade mínima de contagens deve ser superior a 11.000 para ter uma calibração bem sucedida. </li></ol> 4. Raman medições espectroscópicas Todas as medições são realizadas à temperatura ambiente. <ol><li> As definições básicas <ol><li> Usar uma objectiva de imersão em água 60x (Olympus / Alemanha) com uma abertura numérica de 1,2 para recolher o espectro das amostras. </li><li> Alterar as configurações de aquisição a 10 integrações / 10 segundos para um total de 100 segundos por medições. </li></ol></li><li> Medição de células aderentes <ol><li> Pegue o prato com fundo de vidro com as células e colocá-lo no palco microscópio. </li><li> A fim de obter um melhor sinal e garantir a reprodutibilidade, foco do laser sobre o núcleo da célula, transformar a luz do microscópio fora e iniciar a recolha do espectro. </li><li> Meça um espectro de referência do fundo emuito espectros 10, movendo o foco do laser ao lado da célula. É importante considerar que ao mudar o foco um novo fundo devem ser recolhidos para cada profundidade de foco. </li></ol></li><li> Medição de células em suspensão <ol><li> Transferir 100 uL da suspensão de células numa cápsula de fundo de vidro e colocá-la na platina do microscópio. </li><li> Foco do laser sobre o centro da célula, transformar a luz do microscópio fora e iniciar a recolha do espectro. </li><li> Meça um espectro de referência do fundo todos os espectros de 10, movendo o foco do laser ao lado da célula. Ao mudar o foco, um novo fundo devem ser recolhidos para a profundidade novo foco. </li></ol></li><li> Medição dos tecidos nativas <ol><li> Leve a amostra e colocá-lo em um prato fundo de vidro. A região de interesse (RDI) devem ser orientados de frente para o fundo do prato. </li><li> Encha o prato com PBS suficiente para cobrir a amostra. </li><li> Coloque um vidro de cobertura sobre a amostra para evitar qualquer movement da amostra durante as medições. </li><li> Definir o foco do laser na estrutura de interesse (resolução de profundidade é a laser e tecido-dependente) e começar a recolher os espectros. </li><li> Recolher um espectro de referência do fundo todos os espectros de 10 movendo-se o laser de se concentrar para fora da área do tecido todo. Ao mudar o foco, um novo fundo devem ser recolhidos para a profundidade novo foco. </li></ol></li><li> Medição de imunofluorescência (IF)-rotulados criossecções <ol><li> Seção fresco, congelado amostras de tecido usando um cryotom padrão e montá-los em vidros de sílica revestidos de cobertura. </li><li> Manchar os criossecções seguindo um protocolo de rotina para IF, empregando apenas um passo de fixação curto (máximo 10 minutos, com paraformaldeído a 4%) e utilizando anticorpos adequados para a detecção da proteína de interesse. </li><li> Realizar medições Raman centrados na área onde ocorre a fluorescência. </li></ol></li><li> Degradação experimentos elastina <ol><li> Place o ventricularis dos dissecados folhetos aórticos porcinos válvula (elastina-rico, a camada de sangue influxo lado do folheto da válvula cardíaca) voltados para o fundo do prato de fundo de vidro. </li><li> Medir o tecido nativo como um &#39;de controlo não-incubada&#39; menos 30 pontos aleatórios em toda a superfície do tecido todo focagem nas estruturas fibrilares. </li><li> Dividir a amostra em 3 secções e colocá-los em separados 2,5 tubos Eppendorf ml cheios com 2 ml de uma solução de elastase (5 U / ml, Worthington / Alemanha). </li><li> Incubar o tecido para 15 ou 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Após incubação durante 15 ou 30 minutos, remover os tecidos a partir do tubo de Eppendorf e lavar cuidadosamente com PBS, a fim de parar completamente a reacção enzimática. </li><li> Meça cada amostra em 30 pontos aleatórios, concentrando-se nas estruturas fibrilares. </li></ol></li></ol> 5. Processamento de Dados e Análise <ol><li> Processamento de espectros Raman O pré-tratamento doOs espectros de gerado foi realizada usando software OPUS (Bruker Optik GmbH / Alemanha). <ol><li> A fim de reduzir sinais de interferência a partir do vidro e médio bem como para evitar variações provocadas por alterações no foco durante as medições, subtrair o espectro de fundo correspondente a partir dos espectros recolhidos. </li><li> Reduzir o espectro para a região número de onda entre 400-1800 cm -1, que oferece a maior quantidade de informações. </li><li> Se necessário, normalizar os espectros para o pico máximo. Fatores de normalização fora das flutuações de intensidade e falhas sistemáticas, simplificando a detecção de mudanças estruturais no espectro da amostra. </li><li> Realizar uma correção de linha de base para aumentar a comparabilidade entre diferentes experimentos. </li></ol></li><li> Análise dos espectros Raman Os espectros Raman foram analisados ​​utilizando PCA com o software Unscrambler (CAMO / Noruega). Esta análise multivariada detecta diferenças e semelhanças nos dados espectraisconjuntos. Cada espectro é plotado como um ponto único em um espaço multidimensional com base nas contagens coletados para cada turno Raman. Cada componente de princípio (PC) descreve uma certa quantidade, o total de informação contida nos dados originais. O primeiro PC é a que contém a maior fonte de variação. Cada PC a seguir contém, na ordem, menos informação do que o anterior. Cada variável tem uma pontuação e uma carga em cada PC. Ao traçar PCs (= pontos), correlações importantes amostras podem ser expostos. As cargas descrever a contribuição de cada variável analisada para o PCA. <ol><li> Rotular cada grupo de medidas, criando faixas de linha para cada grupo de amostra. </li><li> Utilize as seguintes definições básicas para o PCA: validação cruzada, o algoritmo NIPALS, sem rotação e iniciar a análise. Essas configurações são espectros dependente. </li><li> Execute o PCA. </li></ol></li></ol> 6. Os resultados representativos Raman spECTRA gerada a partir de células aderentes revelam frequentemente uma relação sinal-ruído baixo e uma intensidade de sinal global baixo (Fig. 1). 11 Devido ao facto de que o foco do laser tem de ser definido perto do fundo do vidro, a influência da interferindo sinal de vidro é bastante elevado, causando mascaramento do sinal de amostra real. Por conseguinte, o sinal da amostra pode ser minimizada ou eliminada, mesmo durante um subsequente fundo subtracção. Assim, nós preferimos usar células em suspensão para a nossa análise espectroscópica de Raman, uma vez que permitem a detecção de uma informação mais detalhada espectral. No entanto, os espectros de células aderentes e suspensão exibem os mesmos picos principais diferindo apenas nas suas intensidades. Para a caracterização de tipos de células diferentes dentro de uma suspensão, sem pré-tratamento é necessário. Os espectros de Raman média e desvio padrão de fibroblastos humanos, células estaminais mesenquimais (MSCs), condrócitos e queratinócitos medido em suspensão sãorepresentado na Figura 2. Todos os espectros de Raman são similarmente estruturado, com picos proveniente de biomoléculas típicos, tais como proteínas, ácidos nucleicos e lípidos (ver Tabela 1). 12 Para estes tipos de células, a região espectral entre 600 e 1800 cm -1 contém mais relevante informação espectral, por qual as diferenças claras são detectáveis ​​entre os diferentes tipos de células (Fig. 2A). Exemplar, destacamos uma região espectral (1280-1350 cm -1) apresentando claras diferenças estruturais, que pode ser atribuído às vibrações moleculares de colágeno e lipídios. Em contraste, as alterações morfológicas não são adequados para a identificação e distinção da maioria das células (Fig. 2B-I). Embora a diferença entre os condrócitos e células da pele é observável (Fig. 2D, H versus B, F e E, I), os fibroblastos e os MSCs são difíceis de separar usando unicamente de campo brilhante micrsocopiar (Fig. 2B, F versus C, G). 13 Análise espectroscópica de Raman do tecido nativo, particularmente das proteínas da MEC, requer que um ROI pode ser visualizado por brilhante-campo de imagem, a fim de ser capaz de se concentrar na respectiva estrutura. Para a atribuição de uma proteína a um espectro de impressão digital específica, geramos espectros Raman de proteínas disponíveis comercialmente puros e criosecções immunohistologically manchadas. Aqui, identificamos os espectros de impressões digitais das fibras elásticas em tecidos nativos comparando elastina liofilizado e imunofluorescência manchadas criosecções empregando um anticorpo contra elastina. No entanto, uma vez que a elastina possui uma autofluorescência elevada, o que se reflecte no espectro de Raman, a análise dos dados é um desafio (Fig. 3A). Para reduzir o fracasso sistemático devido à amostra propriedades específicas, tais como, autofluorescência um processamento adequado dos conjuntos de dados é crucial. Em nossos dados de umalyses, utilizou-se a normalização para eliminar a intensidade do sinal significativamente mais elevado da proteína pura de elastina, e assim, fomos capazes de gerar espectros de Raman comparável (Fig. 3B). A elastina é uma das proteínas de ECM mais estáveis ​​do corpo e é, portanto, muito difícil de se degradar. 14 No nosso conjunto experimental acima, nós induzida degradação da elastina em saudáveis ​​suína folhetos da válvula aórtica através da realização de uma digestão enzimática. Aplicando a análise multivariada PCA, identificou-se diferenças significativas entre os espectros de Raman do enzimaticamente tratados com as amostras e controlos nativas (Fig. 3C). Estas diferenças espectrais foram observados no espectro de carregamento em 861, 1003 e 1664 cm1. Esperados alterações estruturais nas fibras de elastina contendo devido aos tempos de exposição prolongados para elastase foram mostradas através de coloração de Hart (Fig. 4), que foram também se reflecte no mais grupos distintos de pontuação separáveis ​​(Fig. 3C). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Figura 1. A média de espectros Raman de fibroblastos destacados e aderente. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Figura 2. (A) A média de espectros Raman e desvios-padrão de quatro diferentes tipos de células isoladas primárias (fibroblastos, células mesenquimais, condrócitos e queratinócitos). A armação destaca a região espectral de 1280 - 1350 cm1 com diferenças estruturais. (BE) de campo brilhante imagens de geminadas (B) fibroblastos, (C) MSCs, (D) condrócitos e (E) queratinócitos. Barra de escala é igual a 20 microns. (FI) de campo brilhante imagens de aderentes (F) fibroblastos, (G) MSCs, (H) e condrócitos i) queratinócitos. Barra de escala é igual a 200 mM. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Figura 3. (A) Os espectros de Raman sem normalização da lyophilized elastina (linha azul), imunofluorescência (IF)-rotulados criosecções (linha laranja) e fibras elásticas (linha vermelha) medidos dentro folhetos da válvula aórtica nativa. A intensidade de sinal de alta da elastina liofilizado é causada por autofluorescência. (B) Os espectros de Raman após a normalização, a fim de eliminar falhas sistémicas. (C) Resultados e cargas da comparação entre controle não-tratado (vermelho) e enzimaticamente degradado (azul e verde) elásticas fibras dentro do tecido nativo. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Figura 4. HART&#39;s manchadas de suínos folhetos da válvula aórtica. As fibras elásticas são visualizados em preto. (A) e (B) mostram controle não-tratado e (C) e (D) mostram amostras de tecido que foram expostos a enzima elastase elastina-degradantes para 30 minutos. <table border="1"><tbody><tr><td> Número de onda em cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Atribuição de 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Fosfolipídios </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> ADN / ARN bases, Backbone OPO </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Fenilalanina </td><td> Proteína </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> III amida </td><td> Proteína </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH 2 </td><td> Proteína / lípido </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amida IC = C </td><td> Lipídeos </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Bandas Raman que são detectados dentro de espectros de todos os tipos de células (fibroblastos, MSCs, condrócitos e queratinócitos).

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Não há conflitos de interesse declarados.

A espectroscopia Raman é uma ferramenta adequada para analisar amostras biológicas, tais como in vitro em cultura de células e proteínas de ECM, bem como células nos tecidos nativas. 11,15,16 Aqui, foi demonstrado que este contacto não-,-label livre técnica permite que o discriminação de diferentes tipos de células e na detecção de ECM degradação de proteínas exclusivamente com base na composição biomolecular intrínseca dessas amostras biológicas. A principal vantagem da espectroscopia de Raman é a capacidade de não-invasiva quantificar a impressão digital bioquímica de uma amostra por sua espectros Raman resultante. Em contraste com a espectroscopia no infravermelho, o que produz informação semelhante, espectros de Raman podem ser recolhidos a partir de amostras aquosas, como a dispersão de Raman a partir de água é fraca. Além disso, espectroscopia de Raman é unicamente com base na detecção de retroespalhamento de luz monocromática, portanto, não é necessário o processamento da amostra de medição anterior. Estes atributos fazem Raespectroscopia homem uma alternativa promissora para o potencial em aplicações de imagem in vivo. Neste âmbito, coerente anti-stokes espectroscopia Raman (CARS) é uma técnica muito interessante, pois permite mais rápido e mais sensível aquisição de dados com base nos mesmos sinais vibracionais utilizadas em nossos experimentos. 15,16 Outros métodos alternativos, incluindo multifotônica induzida por autofluorescência e de imagem de segunda geração harmónica tenham sido previamente demonstrado ser adequada para a monitorização amostras biológicas não-invasiva ou mínima. 17 No entanto, estes métodos de imagem estão associados com custos muito elevados e são limitados a autofluorescência geradoras de moléculas. Além disso, espectrómetro de Raman é fácil de se combinar com microscópios ópticos convencionais. Estas características tornam a espectroscopia Raman uma ferramenta valiosa para estudar amostras biológicas em ambientes fisiológicos. Uma das limitações atuais do nosso espectroscopia Raman é criadoo foco do laser relativamente pequeno (250 nm máximo meia largura total (FWHM) lateral e 700 nm FWHM axial) que é criado por um objectivo alta abertura numérica (NA = 1,2). Embora uma alta abertura numérica permite cobrir uma boa quantidade de luz emitida Raman rendendo em uma relação sinal-ruído elevado, o NA elevada produz apenas um foco de recolha pequena dentro da amostra que é tipicamente muito menor do que uma célula. A fim de comparar os espectros Raman de células diferentes, a recolha de um espectro representativo é essencial, que é difícil de obter, com uma área de focagem pequeno. Para resolver este problema, estamos trabalhando em um processo para automatizar a coleta de sinal em diferentes pontos dentro da célula (= mapeamento Raman espectroscópica), resultando em uma média espectral e ceder a um espectro representativo. Além disso, esta técnica irá fornecer uma visão geral da distribuição de bandas específicas de Raman, por exemplo da distribuição da proteína dentro de uma célula. BiolAs amostras ogical são altamente complexas e consistem de uma mistura heterogénea de biomoléculas que contribuem para os espectros de Raman recolhidos. Portanto, o padrão espectral é altamente complexa e no controlo de um único tipo de uma molécula dentro de um espectro de Raman é difícil de realizar com a sobreposição de sinais de moléculas diferentes. Além disso, a fluorescência intrínseca da amostra pode mascarar informação valiosa de mais fracos sinais de Raman. Curiosamente, em alguns de nossos estudos anteriores, identificamos autofluorescência nos espectros Raman como o principal fator de diferenciação entre tipos de células (MSCs e fibroblastos), utilizando uma ferramenta de análise apropriado 13. Também identificamos que as mudanças na intensidade do sinal Raman global pode servir como um indicador para o estado de colágeno e fibras de colágeno dentro do ECM de folhetos da válvula aórtica. 9 No entanto, ao analisar o estado de elastina nestes tecidos, não foram capazes de detectar resultados semelhantes. Como mencionado no resultadoseção s, que só foram capazes de detectar alterações específicas de bandas Raman nas amostras tratadas com elastase quando comparados com os controles nativos. Nós não vimos uma diminuição do sinal global Raman nas amostras tratadas enzimaticamente como esperado. Estas observações resultou em uma trama pontuação que não revelou uma formação de aglomerados claro como pode ser visto no estudo anterior. 9 Em contraste, a influência do tratamento enzimático foi detectável dentro dos resultados do APC. Supomos que essas discrepâncias entre as duas proteínas de ECM, elastina e colágeno, são baseadas em diferenças morfológicas e diferentes processos de degradação enzimática: dentro do folheto da válvula aórtica, a zona rica em colágeno (fibrosa) é uma camada contínua que fica solta devido à tratamento enzimático, através do qual o elastina contendo zona (ventricularis) tem uma configuração de rede que aparece fragmentado após a exposição a elastase (Fig. 4). Medições pontuais individuais não eram, portanto, aprocomeu para detectar tais pequenas rupturas dentro da rede de elastina. Aqui, um mapeamento de Raman do tecido iria ajudar a identificar avarias de redes. Um outro desafio em espectroscopia de Raman de amostras biológicas é reduzir os tempos de medição. Uma solução consiste em aumentar a potência do laser, que é adequado, desde que as amostras biológicas não são afectados por foto-danos. Todas as nossas experiências em curso são a prova de princípio de estudos com foco em pesquisa básica, no entanto, nosso objetivo geral é implementar a espectroscopia Raman para aplicações clínicas, incluindo a medicina regenerativa (por exemplo, controle de qualidade do tecido de produtos), pré-transplante de monitorização do enxerto e diagnóstico de câncer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> elastase </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> anticorpo anti-elastina </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; tampão citrato </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> pratos de vidro de fundo </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> O Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy

Tecnologias não-destrutiva, sem contato e sem rótulo para monitorar células e culturas de tecidos são necessários no campo da pesquisa biomédica. 1-5 métodos de rotina No entanto, atualmente disponíveis exigem etapas de processamento e alterar a integridade da amostra. A espectroscopia Raman é um método rápido que permite a medição de amostras biológicas sem a necessidade de passos de processamento adicionais. . Esta tecnologia baseada em laser detecta o espalhamento inelástico de luz monocromática 6 Como cada vibração química é atribuído a uma banda específica de Raman (número de onda em cm -1), cada amostra biológica apresenta um padrão típico espectral devido à sua composição bioquímica inerente 7. - 9 Dentro espectros Raman, as intensidades de pico correlacionar com a quantidade das ligações presentes moleculares. 1 semelhanças e diferenças dos conjuntos de dados espectrais pode ser detectado através do emprego de uma análise multivariada (por exemplo, análise de componentes principais (PCA)). 10 </sup&gt; Aqui, nós realizar espectroscopia de Raman de células vivas e tecidos nativas. As células são semeadas quer em pratos de fundo de vidro ou mantidos em suspensão sob condições de cultura de células normais (37 ° C, 5% de CO 2) antes da medição. Tecidos nativos são dissecados e armazenado em tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C medições anteriores. Dependendo do nosso conjunto experimental acima, nós então ou focado no núcleo da célula ou da matriz extracelular (ECM) proteínas tais como a elastina e colagénio. Para todos os estudos, um mínimo de 30 células ou 30 pontos aleatórios de interesse dentro do ECM são medidos. Etapas de processamento de dados incluído subtração de fundo e normalização.

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

A espectroscopia Raman é uma técnica adequada para o contato não, rótulo sem análise de células vivas, tecidos engenharia de construções e tecidos nativos. Fonte específicos impressões digitais espectrais podem ser gerados e analisados ​​utilizando análise multivariada.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

non-contact-label-free-monitoring-cells-extracellular-matrix-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K visualizações.  Eberhard Karls University, Tübingen. A espectroscopia Raman é uma técnica adequada para o contato não, rótulo sem análise de células vivas, tecidos engenharia de construções e tecidos nativos. Fonte específicos impressões digitais espectrais podem ser gerados e analisados ​​utilizando análise multivariada.

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bioengenharia

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Preparação de Matriz Extracelular fibras de proteína de Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Implementação de microscopia de reflexão de interferência para imagens sem rótulo e alta velocidade de microtúbulos

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric field of metallic nanostructures. Salt-induced silver nanoparticle aggregation is the most popular method for generating SERS-active substrates; however, it is limited by poor reproducibility, stability, and biocompatibility. The present protocol integrates optical manipulation and SERS detection to develop an efficient analytical platform to address this. A 1064 nm trapping laser and a 532 nm Raman probe laser are combined in a microscope to assemble silver nanoparticles, which generate plasmonic hotspots for in situ SERS measurements in aqueous environments. Without aggregating agents, this dynamic plasmonic silver nanoparticle assembly enables an approximately 50-fold enhancement of the analyte molecule signal. Moreover, it provides spatial and temporal control to form the SERS-active assembly in as low as 0.05 nM analyte-coated silver nanoparticle solution, which minimizes the potential perturbation for in vivo analysis. Hence, this optical trapping-integrated SERS platform holds great potential for efficient, reproducible, and stable molecular analyses in liquids, especially in aqueous physiological environments.

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

The present protocol describes a convenient approach to integrating optical trapping and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) to manipulate plasmonic nanoparticles for sensitive molecular detection. Without aggregating agents, the trapping laser assembles plasmonic nanoparticles to enhance the SERS signals of target analytes for in situ spectroscopic measurements.

Captura óptica de nanopartículas plasmônicas para caracterizações de espectroscopia raman aprimoradas na superfície de Situ

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric ...