Para começar, transfecte as células do adenocarcinoma do estômago com TMEM200A Si-RNA e incube por dois dias. Em seguida, descarte o meio de cultura celular dos poços e lave suavemente as células duas vezes com um mililitro de PBS. Coloque as células no gelo e adicione 150 microlitros de tampão de lise pré-resfriado de ensaio de precipitação radioimune.
Usando um raspador de células de plástico, retire cuidadosamente as células aderentes da placa e transfira a solução celular suavemente para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado. Em seguida, centrifugar o lisado celular a 1,5 por 10 elevado à potência quatro G por 10 minutos a quatro graus Celsius, e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Usando um kit de ensaio de proteína BCA, determine o teor de proteína seguindo as instruções do fabricante.
Coloque 30 gramas de proteína de cada amostra em um gel SDS-PAGE de 10%. Passe o gel a 80 volts por 0,5 horas, seguido de 1,5 horas a 120 volts. Em seguida, transfira as proteínas do gel para uma membrana de PVDF de 45 micrômetros a uma corrente constante de 300 miliamperes por 1 a 1,5 horas.
Coloque a membrana de PVDF em um agitador por três ciclos de cinco minutos cada. Depois de agitar, adicione TBST ao recipiente com o lado da proteína virado para cima. Coloque a membrana no tampão de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente.
Lave a membrana com TBST por três ciclos de 10 minutos cada. Incubar a membrana com anticorpos primários durante a noite a quatro graus Celsius. Depois de lavar a membrana três vezes com TBST, adicione um anticorpo secundário de coelho ou rato e incube durante uma hora à temperatura ambiente.
Em seguida, adicione substrato ECL à membrana de PVDF por 30 segundos e detecte o sinal usando um sistema de imagem. A eficiência do TMEM200A foi significativamente reduzida na célula de câncer gástrico HGC-27 transfectada com Si-RNA, em comparação com as células não transfectadas. O TMEM200A Si-RNA inibiu significativamente as proteínas relacionadas na transição mesenquimal epitelial e afetou a fosforilação da AKT na via de sinalização da fosfoinositida 3-quinase.
