Olá, meu nome é Bartolomeo Bosco, e sou doutorando no Laboratório de Rede Transcricional do Centro de Biologia Integrativa da Universidade de Trento, na Itália. Como você sabe, a transcrição é um processo extremamente complexo envolvendo organização espacial e temporal do fator de transcrição e cofator. A maioria deles, incluindo o P53 humano, reconhece elementos específicos de ação cis, chamados elementos de resposta, e a vinculação neste sequenciamento de DNA é necessária para a modulação da transcrição dos genes-alvo.
Neste trabalho, gostaríamos de mostrar o protocolo para estudar a sequência P53 específica em funções de transativação usando levedura como um sistema modelo como proteína em um gene repórter de cor ou a luciferase ou sobre a quantificação do crescimento celular para destacar os principais passos experimentais e a versatilidade dessas abordagens. Protocolo um, construção de cepas de levedura repórter que contêm um elemento de resposta P53 específico a montante da adenina-2 ou do gene luciferase de vagalume. Para construir uma cepa de repórter, siga primeiro os passos 1.1 a 1.15 para transformar células de levedura com oligonucleotídeos visando a região promotora desejada.
A transformação é baseada no protocolo padrão baseado em acetato de lítio. Uma vez que os transformadores aparecem em placas 5-FOA, geralmente após três dias de incubação a 30 graus, replize-os em placas YPDA não-seletivas e também em placas YPDA contendo G418, marcando cada placa para facilitar sua comparação subsequente. Incubar as placas durante a noite a 30 graus.
No dia seguinte, identifique o candidato repórter de colônias que são sensíveis ao G418, mas cresceram em placas YPDA. Listrar as colônias identificadas em uma nova placa YPDA para obter isolados de colônia única, e deixá-los crescer por dois dias a 30 graus. Verifique a integração correta do elemento de resposta P53 desejado, realizando uma reação pcr com condições mencionadas na etapa 1.20.
Carregue uma alíquota do produto PCR no gel de agarose para verificar o comprimento correto da amplicon antes do sequenciamento Sanger. Protocolo dois, apresentamos um exemplo de como avaliar a capacidade de transativação de proteínas P53 usando o ensaio qualitativo de levedura à base de cor-2. Transforme células de levedura com vetores de expressão P53 seguindo o mesmo protocolo baseado em acetato de lítio descrito na seção um.
Listrar colônias transformadoras de levedura única, até seis por placa, em uma nova placa seletiva, e deixá-los crescer durante a noite a 30 graus. No dia seguinte, utilizando veludos estéreis, a réplica de placas as listras em novas placas seletivas que permitem a avaliação do fenótipo de cor, ou seja, placas seletivas contendo quantidade limitante de adenina.
Incubar a 30 graus por três dias. As mesmas raias podem ser banhadas várias vezes. Protocolo três, apresentamos agora um exemplo da avaliação da capacidade de transativação de proteínas P53 usando o ensaio quantitativo baseado em levedura LUC1.
Primeiro, transforme células de levedura com vetores de expressão P53 seguindo, novamente, o protocolo baseado em acetato de lítio descrito na seção dois. Remenda transformadores únicos em novas placas seletivas contendo glicose como fonte de carbono, e deixe-os crescer a 30 graus durante a noite. Para cada tipo de transformação, faça de cinco a sete patches diferentes.
Após o crescimento durante a noite, resuspenque uma pequena quantidade de células usando um palito estéril ou uma ponta de pipeta em meio seletivo sintético contendo raffinose como fonte de carbono. Essas suspensões celulares devem ter uma densidade óptica de 600 nanômetros em torno de 0,4 e podem ser divididas em múltiplas placas de 96 poços para incubação a diferentes temperaturas, tratamentos ou para expor células a uma quantidade variada de galactose para ativar a expressão P53. Para medir a atividade do repórter firefly, transfira 10 a 20 microliters de suspensão celular da placa transparente de 96 poços para uma placa branca de 384 poços, e misture as células com um volume igual de tampão de lise, incubando por 10, 15 minutos à temperatura ambiente em um shaker.
Adicione 10, 20 microliters de substrato de luciferase de vagalume. E meça unidades de luz usando um leitor de placas multilabel. Medir também a densidade óptica das culturas na placa de 96 poços.
Protocolo quatro, apresentamos agora um exemplo de como explorar a inibição do crescimento da levedura induzida pelo P53. Transforme células de levedura com vetores de expressão P53, ou cotransforme-as com vetores de expressão para coexpressar P53 e um de seus cofatores, como mdm2, seguindo, novamente, o protocolo baseado em acetato de lítio descrito na seção um. Cresça células transformadoras em meio seletivo para aproximadamente uma densidade óptica.
E diluí-los a 0,05, e adicionar uma molécula escolhida à concentração apropriada. Incubar células a 30 graus em um agitador por 42 horas. Em seguida, sementes 100 microliters de cultura celular de levedura em placas médias mínimas seletivas.
Incubar por dois dias a 30 graus. A integração RE correta no lugar do ICORE pode ser verificada pela colônia PCR, a partir de uma pequena quantidade de células de clones de levedura candidatos e usando primers descritos na tabela três para amplificar o lócus alvo. Os produtos PCR, uma banda de cerca de 500 nucleotídeos, podem então ser verificados pelo sequenciamento Sanger para confirmar a sequência do local genômico editado para a presença da sequência correta do elemento de resposta P53.
A tensão repórter está pronta para ser usada em ensaios funcionais. Para avaliar a capacidade de transativação de proteínas P53, verifique a cor das colônias de leveduras. Por exemplo, apresentamos uma comparação entre o tipo selvagem P53 e os mutantes R175H e R282W usando dois repórteres diferentes, P21-5-prime e PUMA, e duas temperaturas diferentes, 30 graus e 37 graus.
Curiosamente, enquanto R175H é um alehamento P53 de perda de função, colônias vermelhas em todas as condições, R282W mostra sensibilidade à temperatura com atividade de transativação residual a 30 graus, resultando em colônias brancas, mas perda de atividade em 37 graus, resultando em colônias vermelhas ou rosas. Um conjunto de dados estendido é apresentado na figura dois B.Wild-type P53 em quatro alelos mutantes foram testados para transativação usando 10 diferentes cepas de elemento de resposta P53, três temperaturas e níveis de expressão constitutiva. Os resultados são resumidos em um código de cores que lembra o fenótipo de cor da colônia de leveduras.
O alelo mutante P53 K139E mantém atividade parcial e é sensível ao frio. Por exemplo, as colônias são vermelhas na tensão de repórter gadd45 a 24 e 30 graus, mas são brancas a 37 graus. Aqui, apresentamos um exemplo de resultados obtidos com este método, comparando a especificidade de transativação da levedura P53 humana e C.elegans.
Os resultados no gráfico da barra são expressos como unidades de luz relativas médias com erro padrão de quatro réplicas. Foram comparados cinco diferentes elementos de resposta P53. Três níveis diferentes de expressão proteica P53 foram testados variando a concentração de galactose no meio.
Os dois ortologs P53 mostram especificações de transativação marcadamente diferentes. Isso é exemplificado pelos resultados com elementos de resposta ced13 e V1 que compartilham a mesma sequência, exceto pela presença ou ausência de um espaçador de 28 nucleotídeos. O P53 humano exibe transativação muito maior com o local de ligação V1, enquanto C.elegans P53 mostra o oposto.
Os resultados são independentes do nível de expressão P53 sob o promotor indutível galactose. Medir o crescimento da levedura contando o número de colônias obtidas nas 100 quedas da cultura dos microliters. Calcule o efeito de reativação mutante dos compostos considerando o crescimento da levedura selvagem do tipo P53 expressando como o efeito máximo possível, definido para 100% enquanto o crescimento das células expressando p53 mutante representam zero nível de reativação.
Neste exemplo, Nutlin-3a alivia a inibição do P53 tipo selvagem causada pela coexpressão de MDM2, enquanto PhiKan083 reativa parcialmente o mutante Y220C P53. Em ambos os casos, isso resulta em uma redução p53 dependente do crescimento da levedura. As células basais de levedura têm se mostrado úteis para investigar valores, aspectos das funções proteicas P53.
O protocolo descrito neste trabalho é particularmente sensível para avaliar o potencial de transativação do mutante P53 associado ao tipo selvagem ou câncer para variantes de locais-alvo. Além disso, a abordagem pode ser usada para identificar pequenas moléculas que afetam as funções P53 e para estudar a interação P53 com o cofator. O uso dos repórteres coloridos, a miniaturização da luciferase, bem como o teste de inibição do crescimento resultam em ensaios econômicos e escaláveis potencialmente favoráveis à triagem de bibliotecas químicas.
Finalmente, o sistema descrito neste trabalho pode ser facilmente adotado com o estudo de outros fatores de transcrição específicos da sequência.
