Para começar, despeje 100 mililitros de água destilada em um copo contendo 4 gramas de açúcar e 0,8 gramas de ágar. Aqueça a mistura a 100 graus Celsius enquanto mexe continuamente. Retire a mistura do fogo para esfriar.
Abaixe o fogo para manter uma temperatura de 80 graus Celsius. Em seguida, adicione 7,4 gramas de farinha, seguido de 2,8 gramas de fermento à mistura enquanto mexe. Em seguida, adicione a solução de ácido propiónico Moldex à mistura e, em seguida, arrefeça a temperatura até 50 graus Celsius.
Adicione a solução de extrato vegetal de psidium guajava seguida de 0,5 gramas de pó de azul de bromofenol. Despeje a mistura de alimentos preparados em placas de Petri até que cada prato esteja cheio. Depois que os pratos esfriarem à temperatura ambiente, selhe-os com suas tampas e guarde-os em uma geladeira a 4 graus Celsius.
Para preparar os frascos para teste, primeiro prepare os tanques de dióxido de carbono, zarabatana de dióxido de carbono com agulhas, almofada de mosca, pincel e microscópio para manusear as moscas. Selecione frascos contendo pelo menos 10 pupas de Drosophila para padronizar a idade das moscas. Para remover as moscas adultas, inverta os frascos para injetáveis e insira uma agulha entre o tampão de algodão e a parede lateral do frasco.
Anestesiar as moscas adultas usando a zarabatana de dióxido de carbono até que elas fiquem inconscientes no tampão de algodão. Abra o frasco para injetáveis por cima de uma garrafa de vidro contendo etanol a 70% e coloque as moscas nele. Sele o frasco para injetáveis com o tampão de algodão.
Em seguida, incube-o a 25 graus Celsius com 60% de umidade e um ciclo de luz de 12 horas claro e 12 horas escuro. Em seguida, classifique as moscas em fêmeas e machos virgens com a ajuda de um microscópio dentro de oito horas após a incubação para evitar o acasalamento. A genitália feminina pode ser identificada por sua cor pálida, enquanto a genitália masculina tem uma tonalidade avermelhada.
Os machos também podem ser reconhecidos pelos pentes sexuais em suas patas dianteiras. Divida as moscas classificadas em dois tubos frescos, um para cada sexo, e incube-as por 6-8 dias a 25 graus Celsius. Comece empilhando placas de Petri rotuladas umas sobre as outras.
Inverta as placas de Petri com o alimento tingido em papel mata-borrão para absorver o excesso de líquido. Em seguida, use uma espátula para dividir o alimento em cada prato em 12 segmentos iguais. Transfira uma fatia de alimento para uma placa de Petri vazia.
Em seguida, anestesiar as moscas usando dióxido de carbono até que elas estejam dormindo no tampão de algodão. Transfira cuidadosamente seis moscas saudáveis para cada placa de Petri. Coloque os pratos lacrados em uma incubadora.
Para evitar que as moscas escapem durante o experimento, prenda as tampas superior e inferior de cada placa de Petri com fita adesiva. Após um período de criação de 24 horas, anestesiar as moscas novamente usando dióxido de carbono. Em seguida, transfira as moscas para um recipiente cheio de etanol 70% para descarte.
Além disso, descarte qualquer alimento restante dos pratos. Para facilitar a quantificação das placas de Petri, inicie o software Epson Scan 2, atribua um nome de arquivo e execute uma varredura de visualização. Digitalize individualmente as tampas superior e inferior de cada placa de Petri.
Recorte cuidadosamente a digitalização em imagens com um editor de imagens de código aberto para eliminar quaisquer artefatos e resíduos de alimentos e, em seguida, salve a imagem cortada como um arquivo TIFF. Em seguida, inicie o software T.U.R.D.. Clique em Arquivo para criar um novo documento de experimento, atribuir um nome a ele e salvá-lo na subpasta Análise.
Clique na opção Placas e, em seguida, selecione Adicionar placa para escolher a placa de Petri para análise. Uma nova janela aparecerá exibindo os nomes das placas selecionadas junto com novas configurações de parâmetros. Defina o tamanho do bloco como 21, deslocamento para 5, tamanho mínimo para 20 e tamanho máximo para 600.
Para confirmar a precisão da detecção de depósitos fecais, navegue até Placas e clique em Inspecionar Placas Selecionadas seguido de Gráficos e Exibir Imagens Anotadas. Amplie as imagens para rever as contagens de depósito. Se necessário, desmarque os depósitos que não devem ser incluídos na análise.
Após a análise com o software T.U.R.D., ajuste o número de moscas clicando no número de moscas. Altere o nome do grupo clicando em Placas, seguido por Editar Grupos e pressione Adicionar. Selecione o nome do grupo apropriado na coluna Grupo.
Em seguida, clique em Analisar, seguido de Estatística Descritiva e selecione Grupo para exportar os dados de cada réplica separadamente. Salve todos os arquivos de planilha resultantes na mesma pasta designada. Para compilar todos os dados em uma única planilha, abra o aplicativo Excel Merge v4.
Quando solicitado a selecionar o caminho da pasta com arquivos CSV, insira o endereço da pasta e pressione Enter duas vezes para criar uma nova planilha na mesma pasta. Adicione uma nova planilha na planilha com os dados mesclados para calcular a média de cada parâmetro em todas as replicações. Utilize a função PROCV para reunir a média de cada parâmetro de todas as replicações.
Inicie o software GraphPad Prism e insira os nomes dos conjuntos de dados. Transfira os dados da planilha do Excel para o gráfico de dados do Prism. Clique em Analisar para escolher os conjuntos de dados para análise e pressione OK. Escolha os parâmetros de teste apropriados, analise o valor de P.
O número de depósitos fecais, a área total dos depósitos e a DOIO foram significativamente maiores no grupo de alimento normal em comparação com o extrato de P.guajava em machos e fêmeas virgens. O rastreamento do consumo de alimentos sólidos mostrou que não houve diferenças significativas no consumo alimentar entre os grupos de fornecimento e não fornecimento de medicamentos. No entanto, as moscas machos que consumiram loperamida pareceram ingerir menos comida do que o normal.
