O protocolo representa um passo importante para o estabelecimento da drosófila como um modelo padrão para testes de segurança química e para o desenvolvimento de novas metodologias de abordagem comumente chamadas de NAMs. O protocolo descreve um método eficiente e de baixo custo que utiliza meios líquidos para avaliar os efeitos de um produto químico tóxico na viabilidade de adultos de drosophila melanogaster. Comece empilhando quatro folhas de papel cromatógrafo de celulose grau um e cortando-as em tiras de duas polegadas de largura.
Perfure inserções de papel de filtro em forma de flor usando um perfurador de papel de 1,5 polegadas contendo um corante em forma de flor. Empurre a pilha de papel de filtro para o fundo de um frasco de polipropileno de 28,5 milímetros de diâmetro usando uma cavilha de madeira não envernizada de 22 por 220 milímetros. Certifique-se de que a pilha está bem localizada na parte inferior do frasco para injetáveis.
Guarde os frascos preparados em bandejas de plástico ou cartão e coloque as bandejas em sacos plásticos grandes até o uso. Abra o frasco para injetáveis de vidro que contém as moscas, coloque-o na boca do frasco de plástico preparado e transfira as moscas combinadas com sexo para o frasco para injetáveis de fome batendo o fundo do frasco para injetáveis de plástico contra uma bancada. Feche o frasco para injetáveis de plástico com um tampão de acetato de celulose ou flug e registe as moscas perdidas nesta transferência.
Marque os frascos de fome contendo moscas fêmeas com uma listra. Para evitar misturas acidentais, deixe os frascos com moscas de correio sem marcação. Prepare a câmara de umidade para exposição noturna colocando seis toalhas de papel padrão na parte inferior.
Em seguida, molhe as toalhas de papel com 100 mililitros de água e coloque a grade de plástico sobre as toalhas molhadas para garantir que os frascos não entrem em contato com as toalhas de papel saturadas. Depois de colocar as bandejas de frascos para injetáveis de fome em uma posição horizontal dentro da câmara de umidade, transfira a câmara de umidade para uma incubadora de 25 graus Celsius para incubação durante a noite. Para preparar os frascos de exposição química, transfira quatro frascos de moscas fêmeas famintas contendo 20 moscas por frasco para quatro frascos de exposição de cada concentração química.
Rotule estes frascos como femininos. Prepare frascos para injetáveis de exposição química contendo corante azul transferindo um frasco para injetáveis de moscas fêmeas famintas para um frasco para injetáveis de exposição azul para cada concentração química. Rotule este frasco para injetáveis como feminino.
Registre o número de moscas presentes em cada frasco após a transferência e anote o número que morreu ou escapou. Normalmente, todas as 20 moscas devem sobreviver durante a noite à fome e à transferência. Coloque os frascos de exposição horizontalmente em uma câmara de umidade recém-preparada antes de colocar a câmara em uma incubadora de 25 graus Celsius com aproximadamente 60% de umidade e um ciclo de 12 a 12 horas de luz é escuro.
Examinar os frascos para injetáveis de exposição 24 e 48 horas após o início da exposição química. Conte e registre as moscas mortas em cada frasco em cada ponto de tempo. Para determinar se as moscas expostas consumiram o meio de exposição azul nos frascos de exposição azul após 24 horas da exposição química, examine as paredes dos frascos para verificar as indicações de fezes azuis que aparecem como pequenos pontos na lateral do frasco para injetáveis de exposição e do flug.
Em seguida, anestesiar as moscas usando dióxido de carbono antes de examinar os abdômen para a presença de corante azul. Examine as moscas em busca de comportamentos alimentares anormais, como regurgitação, distensão da cultura e quebra da função da barreira intestinal. Uma vez feito, descarte todos os frascos contaminados, papel de filtro, plugues e moscas nos recipientes apropriados para resíduos químicos.
Se as moscas vivas permanecerem nos frascos para injetáveis, congele os frascos para injetáveis antes de os descartar no recipiente de resíduos adequado. A eficácia do protocolo foi determinada pela exposição de órgãos adultos ou moscas machos e fêmeas à faixa de concentrações de arsonita sódica de zero a dois milimolares para pontuar a letalidade após 48 horas de exposição. Em experimentos subsequentes, foram selecionadas concentrações de zero a cinco milimolares que definissem com maior precisão a curva dose-resposta do arsonito de sódio.
Com base nesse modelo, a dose letal final, ou DL 10, DL 25 e DL 50 de moscas machos alimentadas com incenita sódica foi de 0,30 milimolar, 0,50 milimolar e 0,65 milimolar, respectivamente. Esses valores foram ligeiramente maiores para moscas fêmeas com DL 10 de 0,30 milimolar, DL 25 de 0,65 milimolar e DL 50 de 0,90 milimolar. Nos machos e fêmeas alimentados com soluções de arsonita sódica contendo 1%F D e C blue, o alimento ingerido foi ocasionalmente regurgitado em doses acima de 0,2 milimolar para fêmeas e 0,5 milimolar para machos, sugerindo que a regurgitação poderia desempenhar o papel fundamental na resposta da escória à intoxicação por arsênio.
Seguindo este protocolo de exposição, as moscas podem ser facilmente coletadas para análises posteriores, incluindo estudos genômicos e metabolômicos. Este protocolo é o primeiro passo para estabelecer a mosca-das-frutas drosophila melanogaster como um modelo genético comum para a realização de estudos em larga escala de toxicologia de precisão.
