Drosophila melanogaster é um modelo poderoso para avaliar in vivo os potenciais efeitos tóxicos e endócrinos de produtos químicos, como disruptores endócrinos, que representam um grave problema para a saúde humana e ambientes naturais. Abordando o efeito dos EDCs sobre os traços hormonais de vida da mosca, como fecundidade, fertilidade, tempo de desenvolvimento e a vida útil. É uma maneira fácil, barata e rápida de investigar a interrupção endócrina in vivo.
A fertilidade, o desenvolvimento e a vida útil em Drosophila podem ser afetados por vários fatores que devem ser cuidadosamente controlados para garantir o sucesso deste protocolo. Portanto, é necessária máxima atenção na criação e manuseio de moscas. Para avaliar o sabor do EDC selecionado, após a anestesia, transfira 15 moscas jovens do leito de mosca para quatro frascos paralelos contendo meio de fubá misturado com uma coloração alimentar.
O frasco de controle contém apenas o solvente, e os outros três frascos são suplementados com diferentes doses dos EDCs selecionados. Mantenha os frascos em uma incubadora umidificada por um dia com uma luz natural de 12 horas. Depois de anestesiar as moscas novamente, transfira as moscas imobilizadas para um papel branco, e coloque-a sob um microscópio estéreo para observar.
Compare a coloração abdominal de cada grupo de tratamento em relação ao grupo controle. Para avaliar o desempenho reprodutivo das moscas, prepare três frascos de moscas para cada EDC como frascos parentais, com oito fêmeas e quatro machos em 10 mililitros de meio de fubá suplementados com EE2. Para o controle, prepare seis frascos de moscas, cada um com oito fêmeas e quatro machos em 10 mililitros de alimentos médios de fubá suplementados com solvente EE2.
A traseira voa em uma incubadora a 25 graus Celsius. Durante seu desenvolvimento, evite a superlotação das larvas. Após quatro dias, inverta cada frasco sobre um eternte para remover os pais e devolva os frascos à incubadora por mais cinco dias.
No final da tarde do nono dia, inverta cada frasco sobre um etherizer para remover todas as moscas recém-emergidas dos frascos e coloque os frascos em outra incubadora a 18 graus Celsius durante a noite. Na manhã do dia 10, em uma estação de trabalho de dióxido de carbono Drosophila, inverta cuidadosamente o frasco de cultura para evitar que moscas anestesiadas caiam em meio e insira um tubo de borracha com uma agulha no frasco entre a rolha de algodão e a parede do frasco. Abra a válvula para fornecer dióxido de carbono.
Em questão de segundos, transfira as moscas para uma cama de mosca sob um microscópio. Colete fêmeas virgens e machos jovens separadamente em dois grupos na cama de mosca. Subdividir aleatoriamente cada grupo de moscas em pequenos subgrupos, com 10 fêmeas ou 20 machos por frasco preenchido com meio de fubá correspondente fresco.
Continue a incubação e colete 30 fêmeas virgens e 30 machos para cada EDC, e 90 fêmeas virgens e 90 machos para o controle. Abriga esses grupos de moscas a 25 graus Celsius até que tenham quatro dias de idade após a eclosão. Em seguida, transfira-os para novos frascos contendo meio correspondente fresco a cada dois dias.
Verifique se não há larvas nos frascos de fêmeas. Em seguida, rotule frascos com uma série diferente de números sequenciais para o seguinte tratamento. Após a anestesia, transfira uma fêmea tratada com solvente EE2 em um pequeno frasco contendo meio de tomate de fubá fresco sem EE2 e adicione um macho tratado com solvente EE2 para o controle.
Emparelhe um macho tratado com EE2 com fêmea tratada com solvente EE2 ou fêmea tratada com eE2 com macho tratado com solvente EE2 para cada tratamento. Casa 20 cruzes únicas a 25 graus Celsius. Transfira cada par de acasalamento para frascos médios de tomate de fubá fresco sem EDC todos os dias durante os 10 dias seguintes.
Inspecione visualmente cada frasco todos os dias em busca dos ovos e informe seu número na planilha de fertilidade. Em cada frasco, verifique de perto as moscas recém-emergidas e registe o número diário de progens adultos durante o período de 10 dias. Após 10 dias do acasalamento inicial, remova os pais da última série de frascos.
Nos protocolos de ensaio de eclosão, primeiro, para cada grupo de tratamento, estabeleceu 10 frascos de moscas jovens e saudáveis com menos de dois dias de idade, cada um com seis fêmeas e três machos em 10 mililitros de alimentos de fubá sem EDC. Crie as moscas na comida por 24 horas e deixe-as acasalar. Em seguida, prepare outros 10 frascos paralelos por grupo de tratamento com 10 mililitros cada um de alimentos frescos de fubá suplementados com diferentes concentrações de EDC ou o solvente EE2 sozinho para o controle.
Transfira as moscas acasaladas para estes novos frascos. Faça uma planilha de desenvolvimento para gravar as diferentes séries. Deixe as moscas colocarem ovos por 16 horas.
Então, remova os pais dos frascos. Incubar os frascos a 25 graus Celsius por três a quatro dias, ou até que as larvas errantes sejam visíveis. Todos os dias, conte o número de pupas novas em cada frasco escrevendo um número em sequência por cada pupa do lado de fora do frasco para evitar contar a mesma pupa duas vezes.
Informe o número de pupas recém-emergidas por três a quatro dias, ou até que não haja mais forma de pupae. A partir do nono dia, conte o número de adultos emergentes diariamente, até que não surjam mais adultos. Denuncie-o na planilha de desenvolvimento e realize o resto do ensaio de encerramento de acordo com o manuscrito.
No protocolo de vida útil, primeiro montou 20 frascos com oito fêmeas e quatro machos, cada um cheio de 10 mililitros de alimentos de fubá e abriga-os a 25 graus Celsius. Depois de quatro dias, descarte as moscas e coloque os frascos de volta na incubadora. No final da tarde do nono dia, remova todas as moscas recém-emergidas dos frascos e devolva os frascos para a incubadora.
Após 16 a 24 horas, divida 250 moscas adultas de um dia de ambos os sexos em quatro grupos sob anestesia de dióxido de carbono leve e transfira-as para garrafas de 250 mililitros contendo alimentos médios adultos, três complementadas com diferentes concentrações de EDC e uma só com o solvente EE2. Mantenha as moscas a 25 graus Celsius por dois a três dias para permitir que acasalem. Então, classifique cada coorte de moscas por sexo em dois grupos.
Dentro de cada condição de tratamento, para ambos os sexos, subdividir aleatoriamente cada grupo em cinco frascos paralelos a uma densidade de 20 indivíduos por frasco. Prepare uma planilha de vida em que o número de moscas mortas é subtraído do número de moscas sobreviventes da transferência anterior, de modo que o número de sobreviventes em cada transferência seja obtido automaticamente. Após três dias, transfira as moscas sem anestesia para novos frascos contendo os alimentos correspondentes ao mesmo tempo e verifique se há morte.
Regissua a idade das moscas e o número de moscas mortas. Repita a transferência a cada três dias até que todas as moscas morram. Neste experimento, as curvas de vida foram traçadas como a sobrevivência cumulativa versus os dias decorridos para cada concentração de EDC e o controle.
Para o controle, após um longo período inicial em que a curva de sobrevivência permaneceu relativamente alta, ela declinou exponencialmente após cerca de 60 dias. Após a exposição ao EDC, a curva de sobrevivência das moscas tratadas foi afetada significativamente e apresentou declínio dramático após 36 dias. É aconselhável que os frascos paralelos em análise devem ser muito semelhantes, caso contrário será difícil entender qual descartar.
Por isso, sugerimos tomar muito cuidado, adotando uma boa prática experimental, utilizando um grande tamanho amostral. Seguindo esses protocolos, também é possível avaliar o impacto transgeracional de um disruptor endócrino selecionado, bem como testar os potenciais efeitos aditivos de uma combinação de diferentes disruptores endócrinos.
