Este método é utilizado para avaliar a motilidade da cultura através da contagem da contração da cultura e da detecção da distribuição dos alimentos apenas no digestivo. A vantagem dessa técnica é que ela avalia continuamente a motilidade da cultura. É de baixo custo e fácil de executar.
Este método permite usar apenas o preenchimento como modelo para estudar a função digestiva nas passagens alimentares no trato gastrointestinal. Ajudando a demonstrar o processo será Junmeng Xi, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Mantenha moscas em frascos contendo 10 mililitros de alimentos recém-fabricados em uma incubadora de 25 graus celsius com 60% de umidade e uma luz de 12 horas, ciclo escuro de 12 horas.
Certifique-se de que um grande número do desejo fenótipo voa eclose simultaneamente, culminando moscas jovens com alimentos padrão com levedura seca, em seguida, transfira as moscas adultas para um frasco com levedura molhada e deixe dois dias para a colocação de ovos. Deixe os ovos na incubadora para desenvolver e transferir moscas adultas para um novo frasco para coletar mais ovos. Recolher as moscas machos ou fêmeas fechadas todos os dias e cultuá-las em novos frascos com alimentos padrão para a idade desejada.
Anestesiar as moscas com dióxido de carbono e transferir uma mosca para uma placa de dissecação bem com 200 microliters de PBS. Segure a mosca em seu tórax com um par de pinças e abra o tórax com outro par de pinças e puxe as extremidades em direções opostas para abrir o abdômen. Leve cuidadosamente a colheita e o intestino para fora do corpo e espere a mosca acordar.
Quando a mosca estiver acordada, conte o número de vezes que a colheita contrai em um minuto. Repita a contração contando cinco vezes, esperando 30 segundos entre cada contagem. Pesar o corante azul e dissolvê-lo em PBS a uma concentração de 20%.
Em seguida, misture-o no alimento de manutenção líquida fervida para uma concentração final de 5% durante o processo de resfriamento dos alimentos. Depois de manter moscas em frascos com alimentos de fome por quatro horas, transfira-os para novos frascos com a comida tingida e cultuá-los pelo tempo desejado, tendo em mente que em condições de manutenção o alimento passa pela mosca em cerca de duas horas. Transfira uma mosca anestesiada para uma placa de dissecação bem contendo 200 microliters de PBS.
Use pinças para agarrar a mosca no tórax e remover a cabeça com outro par de pinças, em seguida, transfira o corpo para um novo poço com PBS e lave-o com suave agitação para remover o corante ligado ao corpo. Abra o abdômen com dois pares de pinças e separe cuidadosamente todo o intestino do corpo. Tire a colheita de todo o intestino e coloque-a em um tubo com 100 microliters de PBS.
Coloque o resto do intestino em outro tubo com 100 microliters de PBS e use pontas de pipeta para moer a cultura e o intestino e dissolver o corante em PBS. Repita a dissecação até que sejam coletadas culturas e tripas suficientes. Após a coleta das amostras, centrifufique os tubos na velocidade mais alta por um minuto e transfira 90 microliters de supernascer para bem de uma placa de 96 poços.
Faça uma série de diluições de corante azul padrão em concentrações de uma vez 10 a 7 a 10 para o 4º gramas por mililitro e adicione-as aos poços. Meça a absorvância em 630 nanômetros dos poços e use as medidas padrão para traçar um gráfico de linha de absorvância versus concentração de corante. Em seguida, use a curva para calcular a concentração de corante das amostras.
O ensaio de motilidade de cultura foi usado para contar contrações de cultura em moscas mutantes nprl de três dias de idade e controles de fundo genético. A mutação diminuiu significativamente a taxa de contração da cultura. Para confirmar ainda mais a função do NPRL2 na cultura, o movimento alimentar foi detectado alimentando alimentos tingidos para as moscas.
Todas as moscas tinham quantidades semelhantes de corante na cultura, mas as moscas NPRL2 tinham menos corante no intestino, o que pode estar associado à diminuição da taxa de contração da cultura. Ao digitar este protocolo, certifique-se de que a cultura permanece contato com o corpo e a mosca está viva e acordada. Caso contrário, a cultura perderá a capacidade de contrair.
Durante o processo de dissecção, a cultura e o intestino devem estar em contato. Se o corante vazar para o meio de dissecção, a amostra não poderá mais ser usada. Vamos apenas preencher nosso apetite e a ejeção de alimentos em pouco tempo também pode ser avaliada detectando a quantidade de corante em todo o intestino.
