Gostaríamos de agradecer a Alex Hitchen e Meg Booth por sua ajuda com os julgamentos de acasalamento. Este trabalho foi apoiado pelo NERC concessão NE / H015604 / 1 para TP.

1. Preparação de Fly Alimentos com corante alimentar <ol><li> Pegue um frasco Drosophila padrão com cerca de 20 ml de alimento no fundo (Figura 1). Use a seguinte receita para o mix de alimentos utilizando 1 L de água fervente: 10 g de ágar, 85 g de dextrose, 60 g de farinha de milho, 40 g de fermento, e mexa por 5 min de chiar. Adicionar 25 ml de 10% nipagen uma vez que a mistura tenha arrefecido a 75 ° C. </li><li> Após o alimento ter arrefecido e solidificado adicionar duas gotas (aproximadamente 0,5-1 ml) de corante azul para o início da comida e distribuídos por toda a superfície do frasco (Figura 1). Use um corante de cor diferente, se preferir. </li><li> Deixar a comida durante dois dias no frigorífico de modo a que o corante é absorvido pela camada de topo de alimentos; isso evita a umidade excessiva danificar as moscas durante o período de maturação. Adicionar um pequeno pedaço de papel de seda, se a umidade excessiva ainda é um problema para desfazer-se umidade extra e posteriormenteremova. </li><li> Transferência voa para a comida, individualmente ou em grupos. Nota: As moscas ganhará coloração intestinal dentro de 1 dia de serem colocados sobre os alimentos. Alternativamente, as moscas totalmente maduras sobre a comida tingido antes da experiência (aumento de mortalidade durante o período de maturação, não foi observada a partir de exposição ao corante alimentar). </li><li> Verifique se as moscas tingidos pode ser facilmente distinguidos dos moscas não-tingidos. Se eles não podem ser distinguidas, repetir os passos 1,1-1,4 usando uma maior concentração de corante, ou um corante diferente. </li></ol> 2. Dois ensaios de acasalamento dos machos o uso de alimentos para colorir <ol><li> Para a produção de descendência, configurar vários frascos contendo pares de moscas fêmeas e machos (pequenos grupos de machos e fêmeas também são adequados, apesar de ter o cuidado de evitar a aglomeração de larvas). Permitir que as fêmeas põem ovos e mover as moscas para novos frascos a cada 5-7 dias. Armazenar os frascos a uma temperatura adequada para a espécie de interesse (22 ° C fou D. pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C para D. melanogaster). </li><li> Antes da coleta de moscas experimentais remover todas as moscas dos frascos de coleta em um horário definido, antes de recolher machos e fêmeas para garantir que eles vão ser virgens (D. melanogaster - 6 horas a 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 horas a 22 ° C, e D. subobscura - 24 h a 22 ° C). Nota: Se as moscas não são virgens esse viés vontade o seu comportamento em ensaios de acasalamento 15. <ol><li> Loja e macho maduro individualmente no padrão de 75 x 20 mm frascos de plástico (contendo ~ 20 ml de alimento). Isso evita os impactos negativos sobre o comportamento de acasalamento dos machos e fitness visto em algumas espécies em que os machos são mantidos em grupos de 16. </li><li> Expor metade dos homens para o tratamento desejado (CO 2 anestesia, neste caso). Use um tapete de CO 2 ou toque para expor as moscas durante o tempo necessário. Metade da loja do males em cada tratamento em alimentos de cor até que o acasalamento ocorre. Isto irá torná-los visualmente distinguíveis durante os ensaios de acasalamento. </li><li> Para a transferência de moscas usar um aspirador 17. Rotular cada frasco para identificar tanto o tratamento e o estado de cor do sexo masculino. Aqui, use quatro tratamentos (anestesia, não colorido = G-NC, anestesia, colorido = GC, sem anestesia, não colorida, NG-NC, e sem anestesia, colorido, NG-C). </li></ol></li><li> Transferir fêmeas recém-emergidas em frascos de alimentos frescos a amadurecer como grupos de 10. </li><li> Permitir moscas para amadurecer à idade de acasalamento (D. melanogaster - 3 dias, D. pseudoobscura - 5 dias, D. subobscura - 7 dias: 18 loja voa a uma temperatura adequada para a espécie a ser estudadas (por exemplo, 22 ° C para D. . pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C para D. melanogaster). </li><li> Mova fêmeas para frascos individuais (containing ~ 20 ml de alimento) um dia antes do julgamento de acasalamento para a aclimatação para o frasco de acasalamento. Identifique esses frascos para que os frascos podem ser diferenciados. Tenha cuidado para cegar o experimento usando rotulagem neutral (ie, 1-150) por isso não é possível adivinhar a identidade das moscas em qualquer frasco. Nota: A pessoa que coloca as moscas em cada frasco terá que saber a identidade das moscas colocados em cada frasco como eles vão notar que o tratamento foi manchada. No entanto, o observador que assiste o acasalamento não deve conhecer a sua identidade. Para fazer isso serão necessários pelo menos dois pesquisadores, um para configurar e uma para observar. </li><li> Início aos ensaios de acasalamento entre 10-12 horas, ou em um momento que coincide com a luz que vem no ciclo claro / escuro as moscas estão expostos a (&quot;amanhecer&quot; para as moscas). Adicione duas moscas do sexo masculino para cada frasco de acasalamento (que contém uma única mosca fêmea), utilizando um aspirador. Certifique-se de que os dois homens são de diferentes tratamentos (anestesia oucontrole) e que se tem coloração intestinal para torná-lo possível diferenciá-las umas das outras, e observe que macho é manchada. </li><li> Caso ocorra a cópula, gravar o status do macho que se encaixa (ou coloridas ou não - colorido). Se os testes duram 2 horas, assuma a fêmea não vai acasalar. Nota: 2 horas é adequado para estas espécies, mas outras Drosophila pode precisar de mais ou menos tempo. </li></ol> 3. único macho Trials Acasalamento <ol><li> Para únicos ensaios masculinos, repita Protocol 2 com duas alterações: <ol><li> No passo 2.3 não manter machos em alimentos coloridos. </li><li> No passo 2.7, adicionar apenas um único macho para cada frasco. </li></ol></li><li> No passo 2.8, gravar o momento em que a mosca é adicionada ao frasco, o tempo de acasalamento os arranques e o tempo do acasalamento acabados devem ser gravados. A partir desses valores, calcular o sucesso de acasalamento, latência e duração. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Use pacote estatístico adequado para analise. Se os dados são normais e só tem dois tratamentos, usar t-testes ou equivalente Modelo Linear Generalizado (GLM). Por dois experimentos do sexo masculino, usar testes binomial ou uma GLM binomial que estão disponíveis em qualquer pacote de estatísticas de base. Nota: Para obter os dados de exemplo, todas as análises foram realizadas em R versão 3.0.3 19. </li><li> Verifique os dados de latência de acasalamento e duração de acasalamento para a normalidade, traçando histogramas de latência e duração de frequência para cada tratamento 20, e usando um teste para a normalidade, como Shapiro-Wilk. Se não for normal, transformá-lo, ou usar as estatísticas não paramétricas equivalentes 20. Nota: Para obter os dados de exemplo a partir das experiências individuais masculinos log transformação cumpridos os requisitos de normalidade e variâncias iguais. </li><li> Se os dados podem ser normalizada, de uso de t-testes para examinar as diferenças entre a latência de acasalamento e duração nos ensaios de acasalamento dos machos solteiros quando se usa dois tratamentos 21. Se forem utilizados vários tratamentos,tentar uma análise de variância (ANOVA) 20. Se os dados não podem ser normalizada, tente testes não-paramétricos equivalentes 21. </li><li> Use testes binomial para testar um efeito de qualquer corante alimentar ou 2 anestesia CO sobre o sucesso de acasalamento dos machos competem 20. Se são utilizados vários tratamentos, como é o caso com os dados de exemplo, utilizar uma estrutura com GLM erro binomial 21. </li><li> Para os dois ensaios masculinos nos dados de exemplo, use MLG com estruturas de erro binomial. Um GLM examinou a cor como uma variável de resposta (colorido = 0 e incolor = 1) com as espécies, o estado de gás e tratamento de gás instalado como explicativo variables.One GLM examinado CO 2 como uma variável de resposta (gaseados = 0 e não-gaseados = 1) com as espécies, o estado de cor e tratamento de gás instalados. Em cada caso, o modelo de produzir máxima, e executar simplificação do modelo baseia-se AIC 20. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+gustatory+interneurons+modulating+feeding+behaviour+in+the+Drosophila+brain.">Candidate gustatory interneurons modulating feeding behaviour in the Drosophila brain.</a> PLoS Biology. 3, e305 (2005).</li><li>Kalaw, V., Drapeau, M. D., Long, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+food+coloring+on+longevity+and+viability+of+Drosophila+melanogaster.">Effects of food coloring on longevity and viability of Drosophila melanogaster.</a> Dros. Inf. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+cuticular+hydrocarbons+and+their+effect+on+courtship+in+Drosophila+virilis+and+D.+lummei.">Genetic analysis of cuticular hydrocarbons and their effect on courtship in Drosophila virilis and D. lummei.</a> Behaviour Genetics. 37, 713-725 (2007).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Estes dados mostram que o impacto da anestesia CO 2 é inconsistente entre as espécies, com duas das três espécies com pouco impacto. Nossos resultados sugerem marcação com corante alimentar teve um impacto menor sobre o sucesso de acasalamento dos machos do que o CO 2 anestesia para D. melanogaster. Estas experiências demonstram que os corantes alimentares podem facilmente e barato para ser usado moscas etiqueta para ensaios de acoplamento envolvendo vários machos. Das espécies Drosophila três modelos examinados, apenas D. melanogaster mostrou um efeito de CO 2 anestesia sobre o desempenho do acasalamento em uma situação competitiva. Em contrapartida, nenhuma das espécies mostrou um efeito da coleta do gás em ensaios de acasalamento individuais em termos de latência de acasalamento, contrariamente aos resultados anteriores para D. melanogaster 5. O efeito da concorrência poderia, portanto, ser destacando efeitos de fitness mais sutis de anestesia CO 2, que só são detectáveisem situações em que há competição masculina por homens. Exposição a coleção no início e um dia antes de o julgamento ter um efeito negativo sobre a capacidade dos machos de D. melanogaster para obter um acasalamento. Exposição dois dias antes do julgamento, contudo, não mostrou qualquer efeito. Tanto D. pseudoobscura e D. subobscura não mostrou qualquer efeito da exposição a gás em qualquer dos ensaios. Uma explicação é que D. melanogaster era vulnerável a exposição precoce ao CO 2, porque devem ser recolhidos mais cedo na vida (0-6 hr de idade) do que as outras espécies para garantir os machos são virgem. Daí masculino D. melanogaster desta idade podem ser mais sensíveis como a cutícula da mosca ainda é o endurecimento, em comparação com as outras espécies que tiveram mais tempo para a sua cutícula para endurecer. Em geral, isso apóia a idéia de que os efeitos do CO 2 anestesia são espécies específicas e os investigadores devem testar adequadamente o efeito em suas espécies-alvo. Currently, a maioria dos trabalhos sobre o efeito do CO 2 anestesia foi realizada em Drosophila melanogaster 5,11,22 e, por conseguinte, pode não ser apropriado aplicar a outras espécies relacionadas. O método não-invasivo alternativo apresentado para diferenciar as moscas é corante alimentar. Os resultados sugerem que este tratamento não teve efeito em toda a todas as espécies examinadas. No entanto, enquanto que a sua utilização foi bem sucedida em proporcionar um marcador mais barato e facilmente visível para distinguir entre indivíduos deve notar-se que o corante foi mais fácil de distinguir em D. pseudoobscura e D. subobscura do que em D. melanogaster. Anterior autores têm usado várias cores (vermelho, verde e azul) 4,6. Encontramos coloração azul para ser o mais fácil de distinguir em todas as espécies, em particular D. pseudoobscura e D. subobscura. Usando várias cores permitiria potencialmente experimentos mais complexos, com muitos flie marcados individualmentes. No entanto, os testes preliminares de diferentes corantes são essenciais, já que alguns corantes alimentares não conseguem colorir as moscas, possivelmente ser digerida quando consumidos. Outros corantes podem ter efeitos tóxicos e reduzir a sobrevivência das moscas, e deve ser evitado 14). Métodos de coloração de alimentos alternativos usando manchas mais caras também têm sido utilizados para examinar a integridade intestinal para D. melanogaster 23. Estes podem fornecer uma alternativa, embora mais caro, método de tingimento 23. O método de corante é tão rápido como CO 2 recorte asa como moscas podem ser armazenados em alimentos tingidos da coleção. A absorção dos alimentos foi rápida (~ 3 horas), assim que o armazenamento O / N em alimentos de cor também seria suficiente para marcar moscas, como usado em outros estudos 6. No entanto, a duração da coloração é relativamente curto (~ 4-5 h) em relação ao recorte de asa (permanente) ou de pó fluorescente marcação (10 - 12 dias) 24. Como espécie Drosophilavariar em aparência, corantes diferentes serão mais ou menos eficazes para diferentes espécies, e dado que algumas estirpes (por exemplo, mutantes de knock-out) pode ser vulnerável a alterações na dieta, qualquer utilização do corante requer um teste preliminar da sua eficácia particularmente se mais exposição prolongada a corantes podem ser tóxicos 14. Em contraste com o estudo realizado por Kalaw et al. 14, não foi encontrada uma mortalidade significativa após o armazenamento por vários dias em alimentos coloridos para D. melanogaster (3 dias), D. pseudoobscura (5 dias), ou D. subobscura (7 dias), provavelmente devido à diferença de corante utilizado. O passo crítico para a utilização com sucesso do corante é a etapa 1.5, validando que o corante escolhido funciona bem com as espécies e da estirpe a ser utilizada. Uma técnica alternativa envolve a aplicação de pó colorido para o exterior da mosca antes do uso em experiências de campo 24. Este método tem sido utilizado para rastrear indivíduos no campo devido to da duração da marcação e da facilidade de massa marcação voa 24. Embora não tenhamos explicitamente testado esse método em ensaios de acasalamento, seria importante analisar os efeitos que a poeira poderia ter sobre os sentidos importantes no acasalamento, particularmente em Drosophila 25, 26. Na espécie, no entanto, onde tingimento intestinal não é possível, estes métodos podem ser apropriados. Em conclusão, descobrimos que em duas das três espécies testadas (D. pseudoobscura e D. subobscura) não houve efeito encontrado tanto de CO 2 anestesia ou corante alimentar na capacidade de acasalamento dos machos. Para D. melanogaster um efeito negativo de CO 2 a anestesia foi detectado, mas a coloração de alimento não afetou o sucesso de acasalamento dessa espécie. Em geral, o método do corante proporciona um método não-invasivo, de simples e barata para a identificação de Drosophila indivíduo que é equivalente ou melhor do que os métodos que requerem anestesia de CO 2. Eleé provável que este método poderia funcionar em uma variedade de espécies.

Ao longo das últimas décadas tem havido um interesse crescente em como a seleção sexual e competição entre machos impacto na evolução 1,2. Experiências sobre o comportamento de acasalamento têm desempenhado um papel importante no desenvolvimento e teste de teorias da seleção sexual 3,4. Em particular, a pesquisa com espécies do gênero Drosophila, tem contribuído grandemente para a compreensão da seleção e comportamento sexual. No entanto, é importante investigar se técnicas comumente utilizadas poderia influenciar artificialmente os resultados de experiências de acasalamento padrão 5,6. A anestesia é frequentemente utilizado para o manuseio e identificação em experimentos 7. Por exemplo, as moscas são comumente coletadas antes do acasalamento, ou classificados em genótipos ou tratamentos experimentais utilizando dióxido de carbono (CO 2) anestésico. Em experiências em que dois ou mais indivíduos precisam ser distinguidos, é prática comum para anestesiar a flies e clip parte da ala off para identificar cada indivíduo ou grupo de tratamento 5,8. É fundamental, no entanto, para entender como CO 2 tratamento irá afetar o comportamento. O efeito do CO 2 anestesia foi examinado em Drosophila melanogaster em que os machos expostos ao CO 2 foi significativamente mais longo para acasalar e que teve sucesso de acasalamento menor que os homens ou machos não anestesiados anestesiados utilizando a exposição ao frio 5. Este efeito foi observado tanto quando a anestesia foi aplicado no dia da experiência e quando as moscas foram um dia para se recuperar. No entanto, este estudo foi limitado em ensaios apenas examinando em que um único macho foi apresentado para cada fêmea 5. Um cenário mais realista é para uma mulher encontrar vários machos 9,10, permitindo que a concorrência entre os homens, o que pode permitir a detecção de perdas mais sutis de ginástica masculina devido à anestesia. O uso de anestesia CO 2 também seren encontrada para reduzir a fecundidade e longevidade de adultos de D. melanogaster quando eles são expostos logo após a eclosão, como é comum na recolha virgem voa 11. Uma alternativa para o CO 2 anestesia é marcar moscas alimentando-os alimentos coloridos com corante 4,6,10,12,13. Este corante entra no intestino da mosca e é visível através do abdómen, permitindo moscas coloridas para ser distinguido de moscas sem cor, ou a partir de moscas marcadas com uma cor diferente. Métodos diferem na forma como esta pode ser aplicada: a ser adicionado directamente à alimentação 12, através tingido levedura complementar colar 6, ou através de exposição a um novo substrato tingido comida 13. Essas técnicas de marcação parecem mostrar nenhum efeito sobre o desempenho 4,6 acasalamento. No entanto, um papel examinar directamente os efeitos do mesmo corante alimentar sobre adulto D. melanogaster encontrou uma forte redução na expectativa de vida 14. Trabalhos anteriores também se concentrou almost inteiramente em D. melanogaster, tanto no que diz respeito aos efeitos do CO 2 anestesia 5,11 e corante alimentar 14 métodos. Actualmente, há pouca informação sobre a forma de CO 2 a anestesia ou a utilização de coloração intestinal afecta o comportamento de acasalamento dos outros Drosophila. O seguinte estudo avalia o efeito do CO 2 anestesia sobre o comportamento de acasalamento de três espécies de Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura, e D. subobscura). O efeito de coleta de moscas em CO 2 foi examinado em ambos solteiros e dois ensaios de acasalamento dos machos. O efeito do CO 2 também tem sido observadas variações significativas em D. melanogaster 5 e assim por diferentes períodos de latência entre a exposição ao CO 2 e acasalamento foram testados. Um método de recorte anestesia e asa marcação alternativa: é também avaliada a utilização de corantes alimentares para manchar as moscas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plastic tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TWT-200-061G</td>
			<td>Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine mesh</td>
			<td>Any haberdashery</td>
			<td>-</td>
			<td>Fine curtain mesh is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-376</td>
			<td>Various brands of pipette tips would be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>58.49</td>
			<td>Larger vials or bottles could also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Balls</td>
			<td>Lewis Medical Solutions</td>
			<td>28170</td>
			<td>The size of cotton will vary depending on the size of vials used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Food colouring</td>
			<td>Thesugarcraftcompany</td>
			<td>-</td>
			<td>Other dye colours and brands can have variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>BOC</td>
			<td>BOC 40VK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie Markers</td>
			<td>Steadtler</td>
			<td>Lumocolor 313 S</td>
			<td>Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Salter</td>
			<td>SL3920</td>
			<td>Any stopwatch with a good digital display would be fine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dyeing insects for behavioral assays: the mating behavior of anesthetized drosophila

Experiências de acoplamento usando Drosophila têm contribuído grandemente para a compreensão da seleção e comportamento sexual. Experimentos muitas vezes exigem métodos simples, fácil e barato para distinguir entre indivíduos em um julgamento. A técnica padrão para isso é CO 2 anestesia e, em seguida, a rotulagem ou a asa recorte cada mosca. No entanto, este é invasivo e tem sido demonstrado que afectam o comportamento. Outras técnicas utilizadas para identificar a coloração moscas. Este artigo apresenta um método simples e não invasivo para a rotulagem Drosophila que permite que eles sejam identificados individualmente dentro de experimentos, utilizando corante alimentar. Este método é usado nos ensaios em que dois machos competem para acasalar com a fêmea. Tingimento permitiu a identificação rápida e fácil. Houve, no entanto, alguma diferença na força da coloração nas três espécies testadas. Os dados são apresentados mostrando o corante tem um menor impacto no comportamento de acasalamento de CO 2 em Drosophila melanogaster. O impacto da anestesia CO 2 é mostrada a depender da espécie de Drosophila, com D. pseudoobscura e D. subobscura mostrando nenhum impacto, enquanto que D. machos melanogaster tinha reduzido sucesso de acasalamento. O método do corante apresentado é aplicável a uma vasta gama de modelos experimentais.

Dois ensaios de acasalamento dos machos - O efeito do CO 2 anestesia no comportamento de acasalamento O melhor modelo encontrado para explicar a variação do efeito do CO 2 anestesia continha espécies como um factor (com pseudoobscura D. e D. subobscura fundido, como eles não mostraram diferenças entre si). Em D. pseudoobscura e D. subobscura não houve efeito significativo de CO 2 anestesia no sucesso de acasalamento em dois ensaios do sexo masculino (1.589 Z = 0,087, P = 0,931). Para D. melanogaster, os machos expostos ao CO 2 anestesia teve significativamente menor sucesso de acasalamento (Z1,589 = 2,467, P = 0,014). Houve também uma interação significativa entre espécies e de tratamento (χ 2 = 1,589 6,83, P = 0,009), com um efeito maior a ser visto quando D. melanogaster foram expostos ao gás à cobrança ou 1 dia antes os ensaios (Tabela 1). However, D. machos melanogaster expostos a CO 2 dois dias antes do ensaio experimental não mostrou um efeito de CO 2. Dois ensaios de acasalamento dos machos - O efeito da coloração intestinal no comportamento de acasalamento Modelo simplificação não mostrou efeito significativo de corante alimentar sendo encontrados para qualquer uma das três espécies (P&gt; 0,1). Quando o tratamento ou estado de gás foram incluídos na análise estes foram também não significativo (P&gt; 0,1). As proporções de acasalamentos bem sucedidos para moscas de cor em todos os tratamentos estão apresentados na Tabela 2. A diferença na coloração entre moscas mantidos em alimento colorido e incolor pode ser visto na Figura 1. A intensidade da coloração de alimentos do intestino foi maior em D. pseudoobscura e D. subobscura do que em D. melanogaster. Ensaios de acasalamento única - o efeito do uso de CO 2 anestesia sobre mcomportamento ating Não houve diferença na latência de acasalamento para qualquer uma das três espécies quando o CO 2 anestesia foi usada para recolher recentemente emergiram adultos. Um efeito foi encontrado para a duração do acasalamento em D. subobscura quando foi exposta ao CO 2 dois dias antes de ensaios de acasalamento (Figuras 2 e 3 e Tabela 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografia que mostra frascos de colorido e não colorido Fly Alimentos (A) e da Força de Intestinal Coloração em Male D. Subobscura (B). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig2.jpg" /> Figura 2. A média e 95% de intervalo de confiança para a cópula Latência para as três espécies investigadas em ensaios Homem Solteiro, quando os machos eram anestesiard (barras claras) ou não anestesiados (barras escuras) quando recolhido como Virgins antes da maturidade sexual. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig3.jpg" /> Figura 3. A média e 95% Intervalos de Confiança para Cópula Duração para as três espécies investigadas em ensaios Homem Solteiro, quando os machos foram anestesiados (barras claras) ou Não anestesiados (barras escuras) quando recolhido como Virgins antes da maturidade sexual. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tratamento </td><td> Espécies </td><td> Ensaios No. </td><td> No. moscas colorido que acasalaram </td><td> p-valor </td><td> No. moscas gaseados que acasalou </td><td> p-valor </td></tr><tr><td rowspan="3"> Coleção de CO 2 </td><td> D. mel </td><td> 73 </td><td> 36 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 0,0344 </td></tr><tr><td> D. PSE </td><td>79 </td><td> 41 </td><td> 0,8221 </td><td> 44 </td><td> 0,3682 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 71 </td><td> 40 </td><td> 0,3425 </td><td> 33 </td><td> 0,6353 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Expostos ao CO 2 de 18 horas antes </td><td> D. mel </td><td> 57 </td><td> 28 </td><td> 1 </td><td> 19 </td><td> 0,0163 </td></tr><tr><td> D. PSE </td><td> 65 </td><td> 32 </td><td> 1 </td><td> 31 </td><td> 0,8043 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 68 </td><td> 38 </td><td> 0,3961 </td><td> 35 </td><td> 0,9036 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Expostos ao CO 2 dois dias. </td><td> D. mel </td><td> 56 </td><td> 19 </td><td> 0,0222 </td><td> 32 </td><td> 0,3497 </td></tr><tr><td> D. PSE </td><td> 70 </td><td> 32 </td><td> 0,5504 </td><td> 33 </td><td> 0,7202 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 56 </td><td> 29 </td><td> 0,8939 </td><td> 26 </td><td> 0,6889 &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table> Tabela 1. Os resultados de dois experimentos Masculino escolha para todas as espécies e tratamentos examinados. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Espécies </td><td> Traço </td><td> df </td><td> t-value </td><td> p-valor </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. melanogaster </td><td> Latência </td><td> 58 </td><td> 1.379 </td><td> 0,174 </td></tr><tr><td> Duração </td><td> 58 </td><td> 1.243 </td><td> 0,221 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. pseudoobscura </td><td> Latência </td><td> 109 </td><td> 0,419 </td><td> 0,676 </td></tr><tr><td> Duração </td><td> 109 </td><td> 0,436 </td><td> 0,664 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. subobscura </td><td> Latência </td><td> 83 </td><td> 0,098 </td><td> 0,922 </td></tr><tr><td> Duração </td><td> 83 </td><td> 1.767 </td><td> 0,081 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Os resultados de experimentos de conjugação de solteiro examinar o efeito de Coleta em CO 2 Anaesthesia no Acasalamento Latência e duração. Os testes foram realizados em três espécies de Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura e D. subobscura).

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Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

dyeing-insects-for-behavioral-assays-mating-behavior-anesthetized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

9.7K visualizações.  University of Liverpool. This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those leg movements that result from passive forces and interactions with other legs through the common contact with the substrate. If we want to understand, which part of a given movement is produced by nervous system motor output, kinematic analysis of stepping movements, therefore, needs to be complemented with electrophysiological recordings of motor activity. The recording of neuronal or muscular activity in a behaving animal is often limited by the electrophysiological equipment which can constrain the animal in its ability to move with as many degrees of freedom as possible. This can either be avoided by using implantable electrodes and then having the animal move on a long tether (i.e. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pfl&uuml;ger, 1995; B&ouml;hm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) or by transmitting the data using telemetric devices (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Both of these elegant methods, which are successfully used in larger arthropods, often prove difficult to apply in smaller walking insects which either easily get entangled in the long tether or are hindered by the weight of the telemetric device and its batteries. In addition, in all these cases, it is still impossible to distinguish between the purely neuronal basis of locomotion and the effects exerted by mechanical coupling between the walking legs through the substrate. One solution for this problem is to conduct the experiments in a tethered animal that is free to walk in place and that is locally suspended, for example over a slippery surface, which effectively removes most ground contact mechanics. This has been used to study escape responses (Camhi and Nolen, 1981; Camhi and Levy, 1988), turning (Tryba and Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), backward walking (Graham and Epstein, 1985) or changes in velocity (Gruhn et al., 2009b) and it allows the experimenter easily to combine intra- and extracellular physiology with kinematic analyses (Gruhn et al., 2006).
We use a slippery surface setup to investigate the timing of leg muscles in the behaving stick insect with respect to touch-down and lift-off under different behavioral paradigms such as straight forward and curved walking in intact and reduced preparations.

We describe a method to record motor activity, timed to the electrically recorded tarsal contact signal in a tethered insect, walking on a slippery surface. This is used to study the neural basis of adaptive behavior under reduced influence of mechanical interaction between legs through the substrate.

Estudando a base neural do Comportamento Locomotor Adaptive em Insetos

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Ensaios para detectar estruturas de reflexão de UV e determinar a sua importância na preferência do companheiro usando o Sailfin Molly<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantificação do comportamento de higienização da Drosophila

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...