Para começar, configure o microscópio de epifluorescência. Antes de obter imagens, pré-aqueça a incubadora Stage Top a 37 graus Celsius e passe dióxido de carbono umidificado na câmara a 0,02 litros por minuto. Em seguida, coloque a lâmina com monocamadas infectadas na câmara da incubadora e sele a tampa.
Usando a objetiva de 20X sob iluminação de campo brilhante, selecione as coordenadas X e Y dos campos de visão dentro da monocamada. Otimize os parâmetros de imagem e adquira uma imagem usando um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros. Para minimizar a fototoxicidade, ajuste a fonte de luz para 50% de potência com um tempo de exposição de 50 milissegundos.
Certifique-se de que nenhum pixel esteja saturado e ajuste para detectar toda a faixa dinâmica do sensor de cálcio fluorescente. Configure um loop de imagem e adquira uma imagem em cada coordenada X e Y selecionada em um loop de um minuto, e a imagem nesse loop continuamente. Para vírus marcados fluorescentemente, adquira uma imagem no canal apropriado a cada 10º loop.
Se estiver usando vírus não fluorescentes, realize a coloração de aminofluorescência após a aquisição de imagens. Primeiro, fixe as monocamadas com 100 microlitros de formaldeído. Após a incubação, retirar o fixador e extinguir com 100 microlitros de cloreto de amônio 50 milimolares por 10 minutos.
Após a remoção do cloreto de amônio, permeabilizar as monocamadas com 100 microlitros de Triton X-100 a 0,1% por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução, adicione 100 microlitros de solução de bloqueio e incube por uma hora. Em seguida, remova a solução de bloqueio e adicione 100 microlitros de anticorpos primários iludidos em 1X PBS.
Incube durante a noite a quatro graus Celsius com balanço suave. Após a incubação, remova os anticorpos primários e lave três vezes com 1X PBS. Finalmente, adicione 100 microlitros de anticorpos secundários conjugados fluorescentes iludidos em 1X PBS.
Para evitar o fotoclareamento, proteja a placa da luz e incube por duas horas em temperatura ambiente. Remover os anticorpos secundários após a incubação e corar as amostras com solução DAPI. Em seguida, coloque as monocamadas fixas em 100 microlitros de 1X PBS para geração de imagens.
Coloque a lâmina de volta no palco do microscópio. Recarregue as coordenadas X e Y da execução de imagens ao vivo e crie imagens de cada ponto múltiplo no canal correspondente ao anticorpo secundário usado para coloração. Faça referência às imagens da execução de imagens ao vivo para garantir a captura dos mesmos pontos.
Usando esta técnica, a infecção por rotavírus foi obtida em uma monocamada hIO após a pontuação desta monocamada. Para cepas recombinantes de rotavírus que expressam proteínas fluorescentes, como mRuby, a infecção foi verificada durante imagens ao vivo. Já quando uma cepa que não expressa um marcador foi utilizada, a infecção foi detectada por imunofluorescência após exames de imagem.
