Este protocolo fornece dois métodos para mobilizar C.Elegans para realizar imagens in vivo de cálcio dos músculos da parede corporal. Este método pode ajudar a responder perguntas relacionadas à homeostase de cálcio e manuseio de cálcio, e uma sinapse acessível em organismo geneticamente tratável. Essa técnica pode proporcionar uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a homeostase do cálcio muscular e, portanto, pode ser importante na identificação de condições ou vias moleculares que impactam o acoplamento da excitação através da desregulamentação do ciclismo de cálcio.
Esses métodos podem fornecer insights sobre áreas de pesquisa, incluindo, mas não limitado também, neurobiologia, biologia do desenvolvimento e biologia celular. Essas técnicas poderiam ser adaptadas para estudar uma variedade de tipos de células e C.elegans, outros nematoides relacionados, bem como larvas de filsafat. A demonstração visual deste método é fundamental para que o experimentador possa entender a técnica de dissecção e ser capaz de avaliar com precisão os transitórios de cálcio de animais devidamente imobilizados.
Comece configurando o microscópio para imagens fluorescentes. Use uma câmera CMOS científica capaz de imagens completas em 100 hertz, a fim de rastrear mudanças rápidas nos níveis de cálcio. Controle aquisição de câmera e excitação fluorescente led com um software microgerente em execução no ImageJ.
Use um plug-in eletrônico de plataforma de código aberto que se conecta a uma placa de microcontrolador de fonte aberta externa para gerenciar os pulsos de tempo externos que controlam excitações fluorescentes. Para controlar a lógica de tempo, ative o protocolo de aquisição de microgerente no software de acordo com as instruções dos fabricantes. Use dois LEDs para estimular a rodopsina do canal com luz azul e registrar as alterações de RCaMP.
Ative a rodopsina do canal com LED am com o comprimento de onda de entrada máxima de 470 nanômetros e um filtro de bandpass, e excite o RCaMP com um LED com um comprimento de onda de entrada máxima de 594 nanômetros e um filtro de bandpass. Co-ilumine ambos os LEDs e transmita a luz para o mesmo caminho óptico usando um combinador de feixedicróico. Controle o tempo da iluminação LED com um estado sólido de interruptores controlados por sinais TTL de acordo com as instruções do manuscrito e defina a intensidade do LED com as fontes de alimentação lineares de ruído de carga controladas atuais e programe o protocolo de simulação de luz azul em um simulador.
Neste experimento, ligue a simulação de luz azul após dois segundos de captura apenas da fluorescência RCaMP e use um trem de cinco, dois pulsos de luz azul milissegundos com intervalos de 50 milissegundos para ativar a rhodopsina do canal. Se estiver usando a preparação de dissecção, realize a dissecação de C.elegans com pouca luz. Coloque os animais no prato de dissecção com a base de cobertura revestida de silicone que é preenchida com um milimole de solução extracelular de cálcio preparada de acordo com as instruções do manuscrito.
Cole os animais usando o adesivo de pele tópica líquida com coloração azul ao longo do lado dorsal do verme. E faça uma incisão lateral de cutícula ao longo da cola e interface de verme usando agulhas de vidro. Use uma pipeta bucal para limpar as vísceras internas da cavidade do verme, em seguida, cole a retalho cutícula do animal para expor os músculos da parede do corpo medial ventral para a imagem.
Se usar a preparação de nano-contas, faça uma solução derretida de 5% Agra usando água destilada para um volume final de 100 mililitros. Use uma pipeta Pasteur para colocar uma gota de solução de Agra derretida em um slide de vidro e coloque imediatamente um segundo deslizamento de vidro sobre a parte superior usando suavemente pressão para criar uma almofada de Agra uniforme. Remova o slide superior e em aproximadamente quatro microliters de nano-contas de poliestireno para o meio da almofada.
Em baixa luz adicione quatro a seis C.elegans na solução nano-contas, certificando-se de que os animais não se deitam em cima uns dos outros, e cuidadosamente coloquem um deslizamento em cima. Quando estiver pronto para a imagem, coloque o slide preparado ou a placa de dissecção no microscópio e encontre e concentre-se em um worm usando 10 vezes a ampliação e a iluminação de campo brilhante fraca. Mude para 60 vezes a ampliação na excitação fluorescente RCaMP para identificar um músculo da parede medial do ventrum que é anterior à vulva e no plano vocal correto.
Em seguida, altere o caminho da imagem da ocular para a câmera, puxando o alternador e clicando ao vivo dentro do software de aquisição de dados. Clique no botão ORI no software de aquisição de dados e crie uma caixa em torno do músculo que está sendo focado. No estimulador, ligue a via de estimulação da luz azul previamente programada e clique em Adquirir no software de imagem para capturar a imagem.
Quando os C.elegans são cultivados em retina totalmente trans, incorporando com sucesso a retina e ativando a rodopsina do canal, um transitório de cálcio pode ser evocado. Se os animais não forem expostos à retina totalmente trans, nenhum passageiro de cálcio muscular é acionado. Este protocolo foi usado para investigar a perda de funções de mutantes sca-1, que impactam a bomba de cálcio órticulo sarcoplasmático codificada pelo gene sca-1.
Mas, a preparação da dissecção aumenta nos níveis de linha de base da fluorescência de RCaMP foram observados no mutante em comparação com o controle, sugerindo que a mutação precisa dos níveis elevados de cálcio citoplasmica de repouso. Houve uma diminuição significativa nos níveis de pico de cálcio nos mutantes de esca-1 em comparação com o controle. No entanto, nenhuma mudança foi vista no horário de pico aumentado ou no tempo de decadência da metade.
É importante ressaltar que resultados semelhantes podem ser observados usando a preparação de nano-contas menos tecnicamente desafiadora. A perda de funções de slo-mutantes, que interrompem os grandes canais de potássio ativados de cálcio foram avaliados a fim de investigar mutantes que indiretamente afetam o manuseio de cálcio em C.elegans. Quando os níveis de linha de base de RCaMP foram medidos, os mutantes apresentaram aumento da fluorescência em comparação com os controles.
Ao avaliar a cinética do cálcio não foram observadas alterações nos níveis de pico de cálcio. Os mutantes slo-1(eg142), no entanto, apresentaram um aumento significativo para o horário de pico. O passo mais importante a ser lembrado ao completar o procedimento é preparar animais experimentais em retina totalmente trans.
Sem esta etapa, a rodopsina do canal estará inativa, impedindo que transitórios de cálcio induzidos pela luz sejam acionados. Após este procedimento, a eletrofisiologia e a análise comportamental podem ser feitas para avaliar o impacto funcional de quaisquer alterações observadas na homeostase do cálcio. Utilizando os métodos de imobilização aqui descritos, abre caminho para uma maior exploração da dinâmica do cálcio e demonstra que resultados comparáveis podem ser observados em resposta à estimulação neuronal optogenética e captura de transintes de cálcio muscular usando a técnica de imobilização de contas muito menos desafiadora.
