Várias pessoas contribuíram para o trabalho descrito neste artigo. CVG construiu a configuração experimental, e LS, SHC, e CVG realizados os experimentos. CVG e SHC escreveu o manuscrito. Todos os autores posteriormente participou no processo de revisão e aprovou a versão final do manuscrito. Agradecemos Paulo Sternberg para a cepa GCaMP. Algumas cepas de nematóides utilizados neste trabalho foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que é financiado pelo NIH National Center for Research Resources (NCRR). O programa de análise de imagem MATLAB foi adaptada da utilizada no 18. Os autores foram apoiados pela Boston University e do Massachusetts Life Sciences Center.

1. Configuração óptica <ol><li> Use um microscópio composto padrão com recursos de imagens de epifluorescência. Nós usamos um microscópio Nikon Eclipse Ti-U invertido com um iluminador HG Intensilight. </li><li> Para uma melhor imagem e qualidade de sinal usar uma grande ampliação, o objetivo alta abertura numérica. Normalmente usamos uma Nikon X60 1,4 NA objetiva de imersão em óleo. Em alguns casos, é possível a utilização de mais baixa ampliação (X40, X20), dependendo do nível de expressão do fluoróforo e intensidade do sinal. </li><li> Use uma alta sensibilidade arrefecida CCD da câmara, tal como uma câmera Clara Andor para maximizar a sensibilidade da imagem e minimizar o ruído de fundo. </li><li> Para fluoróforos de cor única utilização do filtro de fluorescência padrão microscópio ajustado concebido para o comprimento de onda particular do fluoróforo. Para usar um padrão GCaMP GFP filtro definido optimizado para a excitação a 488 nm e emissão a 525 nm. Sem mais modificações ópticas são necessárias. </li><li&gt; Para raciométrica fluoróforos, tais como cameleon, utilizar um sistema de imagem dupla de tal modo que as imagens podem ser idênticas simultaneamente capturado em dois comprimentos de onda separados. Isto é realizado por projecção das imagens duplas lado a lado na câmara. Uma configuração simples de conseguir isto, utilizando componentes ópticos básicos sobre uma placa de montagem de grau óptico, encontra-se ilustrada na Figura 1. É constituída por: <ol class="ualpha"><li> Um filtro microscópio definido com 440 ± 20 nm filtro de excitação e 455 nm de comprimento passar espelho dicróico. </li><li> Uma máscara colocada no plano da imagem inicial imediatamente fora do microscópio de imagem da porta (onde a câmera sensor CCD normalmente sentar). Isto restringe o campo de visão tal que irá preencher apenas metade do sensor da câmara. Colocando a máscara para os resultados de imagem primeiro plano na imagem fronteiras nítidas e sem sobreposição quando as duas imagens são projectadas lado-a-lado. </li><li> A lente primeiro relé definir uma distância focal longe de tele plano de imagem inicial de tal forma que colima a luz. </li><li> Um espelho dicróico que divide a luz em dois comprimentos de onda de imagem separados ou canais que reflectem uma cor (&gt; 515 nm, amarela), enquanto que o outro transmissor (&lt;515 nm, ciano). </li><li> Filtros de emissões (filtros passa-banda) restringindo ainda mais a luz transmitida para os comprimentos de onda específicos de imagem (ciano de 485 ± 40 nm e amarelas em 535 ± 30 nm), </li><li> A segunda lentes de retransmissão (uma para cada canal) colocados nos percursos dos feixes esses que reorienta a luz para um plano de imagem segundo a imagem da câmara CCD. </li><li> Um par de espelhos e um espelho dicróico segunda dirige os percursos dos feixes de modo que as duas imagens e recombinadas são projectadas lado-a-lado sobre o sensor CCD da câmara. Figura 4A mostra um exemplo da imagem resultante. </li></ol></li><li> Alinhamento óptico inicial: Iniciar configuração e alinhamento da óptica com uma imag alto contrastee usando uma lente de ampliação baixa iluminação e da luz transmitida de campo amplo (a preto sharpie desenhada numa lâmina de microscópio funciona bem). Trazer a imagem para focar através das oculares de microscópio e em seguida comutado para a porta de microscópio para ser usado. Com iluminação de luz alta visualizar a imagem em um cartão de índice no plano inicial focal (alguns centímetros fora do porto microscópio). Posicionar a lente do primeiro relê (C) no caminho do feixe de forma que ele é uma distância focal a partir do plano focal inicial e colima a luz, enquanto não desviar o percurso do feixe (isto é, está directamente centrado no caminho do feixe). Coloque a máscara no primeiro plano focal, ajustados para restringir metade do campo de visão e produzir uma fronteira nítida na imagem. Posicionar os espelhos e filtros (D, E, G) de tal forma que o percurso do feixe permanece paralelo à superfície da mesa e é executado em dois caminhos paralelos lado a lado, como mostrado na Figura 1B. Centro das lentes de retransmissão segundo (F) nos seus respectivos percursos dos feixes emovê-los e para trás ao longo dos caminhos para levar as imagens para um foco em um cartão colocado foi o sensor CCD da câmera será. Se feito corretamente as duas imagens deve ser parfocal com as oculares de microscópio e portos outras câmaras. Finalmente coloque a câmera na posição e ajustar o alinhamento. </li><li> Alinhamento Sintonia fina óptica: Use a imagem dupla visto pela câmera CCD para afinar o alinhamento óptico. Usar uma imagem de alto contraste e iniciar com menor ampliação, a mudança para uma ampliação maior para o alinhamento final. Posicionar a imagem transmitida (ciano canal na Figura 1B), para cobrir uma metade do campo da câmara de vista movendo a câmara na posição X e Y. da imagem reflectida (canal amarelo na Figura 1B), para cobrir a outra metade da área de ver, ajustando os últimos dois espelhos (G), no seu caminho do feixe. Optimizar concentrar movendo a lente segundo relê para cada canal e para trás ao longo do percurso de feixe. Se esquerdoconfiguração do inalterado óptico deve ser estável e só requer ajuste sintonia rara multa. </li></ol> 2. Preparação de amostras e Aquisição de Dados. <ol><li> Adquirir animais que expressam um fluoróforo de cálcio no neurônio sensível de interesse do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) ou de outras fontes. Animais transgénicos Alternativamente pode ser construído usando o padrão C. técnicas elegans. Expressão única célula não é necessária (e por vezes não é desejável se os neurónios são múltiplos a ser investigado, ver 12), desde que as imagens e as medições de várias células pode ser prontamente separados. Se o transgene fluoróforo não é integrado no genoma, uma variação significativa na expressão pode ocorrer de animal para animal. Neste caso, a pré-selecção de animais com níveis mais elevados de expressão, utilizando um microscópio de dissecação fluorescente aumenta a relação sinal-ruído e melhora as medições. Fluoróforo níveis de expressão need de ser suficiente para ser facilmente visualizado com a câmara sob os parâmetros de aquisição exigidos pela experiência. </li><li> Fazer as almofadas de agarose necessários para a técnica de imobilização desejado (ver 2.3), pressionando uma pequena gota de agarose fundida entre duas lâminas de vidro espaçadas por dois pedaços de fita de laboratório. Se necessário, as almofadas de agarose podem ser transferidas para uma lamela de vidro antes da montagem dos animais. Veja a Figura 2. </li><li> Imobilizar C. elegans para imagens utilizando uma das técnicas seguintes: <ol class="ualpha"><li> Paralisação Farmacológica: Adicionar Levamisole 0,05% a almofadas de agarose (2% de mistura-o na agarose fundida, antes de fazer as almofadas em 2.2). Escolha 5-10 animais para a almofada e cobrir com uma lamela. Aplicar pequenas quantidades de mistura de cera quente (cera de parafina a 50% e 50% de vaselina), para os cantos da lâmina de cobertura para mantê-lo em posição. Permitir 5-10 minutos para o Levamisol para ter efeito e os animais para become completamente imóvel. </li><li> Imobilização Agarose Stiff: C. elegans pode ser fisicamente imobilizado utilizando almofadas rígidas 10% de agarose e 0,05 uM nanopartículas de poliestireno diâmetro. Fazer almofadas de agarose a 10% (10% de agarose em tampão NGM em peso) como em 2.2. Adicionar ~ ul de solução de esferas 3 (1:10 microesferas de poliestireno em NGM por volume) para a parte superior da almofada. Rapidamente, escolha C. 5-10 elegans na piscina de solução de esferas na almofada e suavemente cubra com uma lamínula. Use cera fundida aplicada aos cantos da lâmina de cobertura para mantê-lo em posição. (Para detalhes adicionais sobre a técnica ver 7, bem como um artigo JoVE anterior 8) </li><li> Colagem: C. elegans pode ser colada no local usando pequenas quantidades de adesivo de grau veterinária aplicada a um lado do animal. </li><li> Dispositivos microfluídicos: Inúmeros dispositivos microfluídicos foram projetados para segurar fisicamente C. elegans no lugar para imagens. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Coloque o slide preparado no microscópio e focar no neurônio desejado. É muitas vezes mais fácil de encontrar o C. elegans utilizando iluminação de campo claro e baixa ampliação. Em seguida, mudar para alta ampliação e imagens de fluorescência para encontrar e focar no neurônio específico. </li><li> Estímulo: Se uma resposta neuronal a um estímulo específico for desejado (campo, luz eléctrica, sinais gustativos e olfactivos, temperatura, etc), o aparelho de estímulo devem ser concebidas para a instalação de microscópio, de tal forma que ele pode ser administrado aos animais no a preparação da amostra, enquanto imagens. </li><li> Aquisição de imagens utilizando o microscópio câmera CCD. Os tempos de exposição e nível de luz de excitação depende do sinal de referência e o nível de expressão do fluoróforo, com sinais mais fracos que requerem tempos de exposição mais longos com resolução de tempo concordante menos. Normalmente usamos ~ 300 vezes a exposição ms. </li><li> Adquirir imagens individualmente ou como um time-lapso filme. Porque C. neurônios elegans geralmente exibem dinâmica de ativação lenta (ou seja, eles não têm potencial de sódio base de ação), taxas de quadros relativamente lentos de ~ 1 seg são muitas vezes suficientes para medir neurônio dinâmica. Taxas de aquisição até ~ 90 quadros por segundo têm sido usados, embora estes possam ser limitado pelo tempo necessário para a integração de fluorescência fraca. Os filmes individuais de um único neurónio pode facilmente estender-se por alguns minutos (~ 5-10 min), ou mais se a preparação é estável e imobilização a taxa de quadros relativamente lenta. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Há uma série de diferentes pacotes de imagens fluorescentes de software disponíveis com as capacidades de análise dinâmica e raciométrica incluindo ImageJ e NIS-Elements. Nós usamos um simples costume programa MATLAB, que mede a média do sinal fluorescente sobre uma região de interesse selecionada. </li><li> Para imagens individuais (ou time-lapse filmes que permanecemperfeitamente imóvel) selecionar uma região de interesse (ROI) dentro do neurônio com imagens e uma região separada próxima para a medição de fundo. Para imagens raciométrica seleccionar ROI semelhante e as regiões de fundo para cada uma das imagens duplas. </li><li> Ligeiro movimento do neurônio com imagens dentro de um filme de lapso de tempo requer uma análise adicional para selecionar automaticamente o ROI em cada quadro, o que pode ser feito usando esquemas de rastreamento inúmeros objetos. Nosso programa exibe uma imagem compactada de todas as imagens do filme a partir do qual um limite bruto (abrangendo o objeto de interesses em todos os quadros) é manualmente selecionados e uma região de fundo independente selecionada. Para o primeiro quadro, um ROI é manualmente selecionadas dentro da região de fronteira. Para cada quadro subsequente, o programa selecciona os pixels mais brilhantes de dentro da região de fronteira para gerar um ROI de tamanho correcto (isto é, o mesmo número de pixels, como o ROI armação manual do primeiro). Para imagens onde o object de interesses é suficientemente brilhante, então o fundo em torno na região de fronteira este protocolo seleciona um ROI razoável para cada quadro. </li><li> O sinal de fluorescência, F, de cada quadro é calculado como a média de intensidade de pixel do ROI, menos a intensidade média da região do fundo. Os valores de medida proporcional são calculadas como a razão entre os dois sinais (YFP-YFP fundo) / (CFP-PCP fundo) -0,65. O factor de 0,65 compensa purga através do canal para o canal PCP YFP, que será dependente dos fluoróforos, bem como o conjunto de filtros particular usado (este valor é tipicamente ~ 0.6 para configurações cameleon). </li><li> O nível de cálcio em relação a cada quadro é calculada como a percentagem de alteração na intensidade normalizada para um valor de linha de base inicial medido a partir do primeiro quadro (ou uma série de quadros): Af / F = (F (t)-F o) / F o, em que F (t) é a fluorescência no tempo t e o Fé o valor de referência inicial. </li><li> A selecção do organismo ROI célula gera os sinais mais fortes mais robustas, mas também é possível seleccionar e medir os sinais a partir de uma ROI ao longo dos processos nervosos. </li></ol> 4. Resolução de Problemas <ol><li> Branqueamento: A exposição a luz de excitação pode causar descoloração do fluoróforo e é marcada por uma diminuição constante no sinal que é dependente do nível de exposição. Medições raciométrica ajudar a compensar esta situação. No entanto seletiva de branqueamento de um comprimento de onda ainda pode ocorrer (normalmente alvejantes PCP mais rápido, então YFP). Se ocorre branqueamento reduzir o nível de exposição à luz, reduzindo o tempo de exposição e / ou de intensidade de excitação (com filtros de densidade neutra na via de iluminação). Se necessário, pode-se compensar de branqueamento, executando testes simulados (com a mesma exposição excitação mas nenhum estímulo neuronal) e quantificando a constante de tempo de decaimento do sinal. </li><li>C.. elegans responder à exposição à luz e estímulos experimentais, tornando-os mais susceptíveis de se mover, no momento da gravação. Ligeiro movimento pode introduzir ruído significativo na medição especialmente quando se mede a partir de processos de axônios. Análise raciométrica ajuda a minimizar estes efeitos, em certa medida e de medições a partir do corpo das células são mais robustas. Execução cuidadosa e refinamento dos procedimentos de imobilização irá resultar em animais completamente imóvel. </li><li> Escolha do Fundo: A seleção cuidadosa de uma região de fundo é necessário para a análise de imagem de sucesso. Regiões fundo deve ser razoavelmente uniforme e mais escura, então o neurônio imagens. Deve ser suficientemente removidos para evitar a luz difusa (e, portanto, um captador de sinal) do neurónio imagens. Nós encontramos uma região uniforme 20-50 uM do ROI funciona bem na maior parte dos casos. </li><li> Óptica raciométrica: O alinhamento correto da ótica de imagem é fundamental para a geração de uma imagem clara dupla. Anexos microscópio comerciais para imagiologia raciométrica estão disponíveis. Uma técnica alternativa é empregar imagiologia sequencial rápida utilizando uma roda de filtro rápido para rapidamente alternar entre comprimentos de onda de emissão durante a gravação de imagens separadas para cada um. </li><li> Análise raciométrica: A análise aqui descrito é uma técnica relativamente simples que gera sinais robustos em virtude de uma média de mais de um ROI. Ele requer um objeto reconhecidamente brilhante para selecionar o ROI. Uma análise mais sofisticada raciométrica é possível alinhar com precisão e mapeamento das imagens duplas tais que a razão de fluorescência podem ser calculados pixel a pixel. </li></ol>

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	<li>Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxic+MEC-4(d)+DEG/ENaC+sodium+channel+conducts+calcium:+implications+for+necrosis+initiation.">The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation.</a> Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Indicadores de cálcio geneticamente codificados têm sido amplamente utilizados em C. elegans neurobiologia. Numerosos grupos têm utilizado as técnicas para estudar a resposta de neurónios sensoriais primários a estímulos externos, como aqui demonstrado com a resposta ASJ a um campo eléctrico. Exemplos proeminentes incluem sensação de toque mecânico, produtos químicos específicos, temperatura e um campo elétrico 12, 16-19. Actividade de células do músculo interneurônio e também foram...

Aqui apresentamos métodos práticos para em imagens de cálcio vivo em C. neurônios elegans. O desenvolvimento de codificados geneticamente cálcio sensíveis fluoróforos com relação sinal-para-ruído de alto torna C. elegans um sistema relativamente simples e de baixo custo para a medição da neurofisiologia e da atividade. Nossa imagem é feita com um microscópio composto padrão, utilizando de campo amplo imagens de fluorescência de fluoróforos disponíveis correntemente. Nós apresentamos várias técnicas que empregam vários fluoróforos e preparações diferentes de amostra, discutir os pontos fortes e fracos de cada um. Os dados são então apresentados a partir de duas experiências de exemplo. Um excelente recurso adicional sobre as técnicas descritas aqui podem ser encontrados em WormBook, &quot;Imaging a actividade dos neurónios e músculos&quot; por R. Kerr, ( <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Duas grandes classes de geneticacamente codificados repórteres cálcio fluorescentes são comumente usados ​​em C. elegans: GCaMP único canal e FRET baseada cameleon. Vamos descrever métodos e mostrar exemplos de dados gerados por cada um. GCaMP baseia-se numa modificação Green Fluorescent Protein (GFP) que é sensível à concentração de cálcio circundante. Isto é realizado através da fusão de GFP e a alta afinidade da proteína de cálcio calmodulina, de tal modo que a ligação do cálcio por calmodulina traz a molécula GFP em uma confirmação eficiente fluorescente 2. Os avanços recentes no tamanho destes fluoróforos gerar sinal excepcional com aumento até 500% na intensidade de fluorescência ao longo de um intervalo fisiológico dos níveis de cálcio e de cinética razoavelmente rápidos de ~ 95 ms de tempo de subida e o tempo de decaimento ~ 650 mseg 4. Ao longo de períodos de tempo relativamente curtos (min), estes sinais grandes podem permitir a imagiologia de resolução mais baixa (inferior a ampliação) e, dado um bem comportado o initaferição ial, negar a necessidade de linha de base contínua ou medições comparativas. Cameleon tem a vantagem de ser um fluoróforo com base em FRET, que gera uma medição raciométrica comparando dois canais independentes ou comprimentos de onda 1. É constituída por dois fluoróforos separadas (ciano e amarelo emissores de proteínas fluorescentes, PCP e YFP) ligadas por uma proteína calmodulina. O complexo é iluminado com luz azul (440 nm) que excita o PCP. A ligação de cálcio traz os fluoróforos mais juntos, o aumento de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), a partir da PCP (dador) para o YFP (aceitador) e provocando a emissão de PCP (480 nm) para diminuir a emissão e YFP (535 nm) para aumentar . Os níveis de cálcio são medidos em relação como a razão entre a intensidade de YFP / PCP. Cinética Cameleon são mais lentos do que a de GCaMP, medido in vivo para ter um tempo de subida de uma sec ~ e um tempo de decaimento de ~ 3 seg 5. No entanto,a razão entre os sinais que se deslocam em oposição aumenta o tamanho do sinal e compensa para um certo número de possíveis artefactos devido a alterações na concentração de fluoróforo de movimento, ou o desvio de focagem e de branqueamento. Codificados geneticamente repórteres fluorescentes anular grande parte da preparação da amostra necessária com sondas exogenamente administrado e C. elegans pequeno corpo transparente permite imagens dentro do animal intacto utilizando fluorescência de campo simples de largura. O principal desafio técnico na preparação da amostra é, portanto, de forma segura para imobilizar os animais. Há um número de diferentes técnicas usadas cada uma com vantagens e desvantagens. Usando um agente farmacológico para paralisar os animais é fácil de implementar e permite que a montagem de vários animais em uma preparação (Levamisole, um agonista colinérgico que provoca o tecido do músculo para aproveitar é tipicamente usado 6). C. elegans pode também ser fisicamente imobilizado por montá-losna dura de agarose a 10% 7, 8. Isto minimiza o impacto sobre a fisiologia do animal, permite que a longo prazo de imagens (horas) e recuperação de vários animais, mas é mais difícil tecnicamente. Ambas as técnicas de restringir o acesso físico para os animais (que se encontram sob uma lâmina de cobertura) e podem, portanto, ser utilizados apenas com certos estímulos experimentais (tais como a luz, a temperatura do campo eléctrico ou danos no laser). Para estímulos onde o acesso físico é necessário, como o toque ou a administração de produtos químicos, muitos estudos com sucesso colado C. elegans em vigor (usando cola grau veterinária) 9. Isso é tecnicamente mais desafiador, é uma preparação único animal e não permitir a recuperação dos animais. Por fim, vários dispositivos têm sido utilizados microfluidicos que fisicamente conter C. elegans, preservando a fisiologia animal, permitindo que a exposição à maioria dos tipos de estímulos (dependendo da concepção do dispositivo) e pode permitir a troca rápida e recuperação dos animais <sup&gt; 10, 11. Porém a microfluídica exigem habilidades técnicas adicionais e capacidades em fabricação, design e implementação. Em imobilizada actividade dos animais e de resposta a estímulos podem ser geralmente medidos em sensorial e interneurónios. Atividade dos neurônios motores requer técnicas mais sofisticadas para geração de imagens de animais em movimento. Aqui iremos apresentar métodos detalhados empregando as duas técnicas mais simples de paralisação e imobilização farmacológica com agarose dura. Os métodos aqui apresentados podem ser usados ​​para medir a actividade neuronal e da fisiologia celular em C. elegans. Nós dar um exemplo de cada um: usando GCaMP para medir a resposta do neurônio sensorial ASJ a um campo elétrico externo, e usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio a danos de laser de um neurônio. Estes exemplos demonstram as vantagens e desvantagens dos dois tipos de fluoróforos e ilustram o que é possível com o sistema.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eclipse Ti-U inverted 
 microscope</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intensilight HG Illuminator</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>C-HGFI</td>
 <td>Fluorescent light source</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical table or 3'X3' optical 
 grade breadboard</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>If an optical table is not used an 
 optical grade breadboard on a 
 solid laboratory bench should 
 suffice.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clara Interline Camera</td>
 <td>Andor 
 Technology</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>High-sensitivity CCD camera</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>wtGFP Longpass Emission</td>
 <td>Chroma Technology 
 Corp.</td>
 <td>41015</td>
 <td>GFP filter set for imaging GCaMP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 440 +/- 10 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D440/20x EX</td>
 <td>excitation filter for cameleon</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 455 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>455DCLP BS</td>
 <td>microscope dichroic for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 515 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>515DCLP BS</td>
 <td>dichroic mirror for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 535 +/- 15 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D535/30m EM</td>
 <td>YFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 480 +/- 20 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D485/40m EM</td>
 <td>CFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lens, 200 mm, Achromat</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>AC508-200-A1</td>
 <td>Relay lens for FRET optics (3)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver broadband mirror</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>ME2S-P01</td>
 <td>FRET optics (2)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NGM buffer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polybead Microspheres</td>
 <td>Polysciences, Inc.</td>
 <td>08691-10, 2.5% by 
 volume, 50 nm 
 diameter</td>
 <td>polystyrene nanoparticles for C. 
 elegans immobilization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, Strain 
 gpa-9::GCaMP3(in pha-1; 
 him-5 bkg) </td>
 <td>Sternberg Lab</td>
 <td>Strain PS6388</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, mec- 
 4::YC3.60</td>
 <td>Gabel Lab</td>
 <td>Strain CG1B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in vivo neuronal calcium imaging in c. elegans

O verme nemátodo C. elegans é um organismo modelo ideal para imagens relativamente simples, de baixo custo neuronal in vivo. O corpo transparente e simples pequeno, bem caracterizado, sistema nervoso permite a identificação e imagens de fluorescência de qualquer neurónio dentro do animal intacto. Técnicas de imobilização simples, com um impacto mínimo sobre a fisiologia do animal permitir imagens com lapso de tempo prolongado. O desenvolvimento de fluoróforos geneticamente codificados de cálcio sensíveis como cameleon 1 e 2 permitem GCaMP imagem in vivo de cálcio neuronal relacionada a fisiologia celular e da atividade neuronal. Foram identificadas numerosas estirpes transgénicas que expressam estas fluoróforos em neurónios específicos estão prontamente disponíveis ou podem ser construídos usando técnicas bem estabelecidas. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para medir a dinâmica do cálcio dentro de um único neurônio in vivo utilizando tanto GCaMP e cameleon. Discutimos vantagens e disadvantidades de ambos, assim como vários métodos de preparação da amostra (imobilização de animais) e análise de imagem. Por fim, apresentamos os resultados de dois experimentos: 1) utilizando GCaMP para medir a resposta sensorial de um neurônio específico para um campo elétrico externo e 2) Usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio de um neurônio a danos de laser traumático. Técnicas de cálcio de imagem, como estes são usados ​​extensivamente em C. elegans e foram estendidos para medições em animais livremente móveis, neurônios múltiplas simultaneamente e comparação entre fundos genéticos. C. elegans apresenta um sistema robusto e flexível para a imagiologia neuronal in vivo com vantagens sobre outros sistemas de modelos em simplicidade técnica e custos.

Aqui apresentamos os resultados de dois experimentos distintos. O primeiro utiliza GCaMP para medir a resposta de um neurónio sensorial específica a um estímulo externo definido, que dá um bom exemplo de como repórteres fluorescentes de cálcio pode ser utilizado para monitorizar a actividade neuronal opticamente em C. intacto elegans. O segundo emprega cameleon para medir a concentração de cálcio intracelular transiente provocado dentro de um neurónio, em resposta ao dano do laser específico...

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e reagentes,<em&gt; C. elegans</em&gt; Faz um organismo modelo ideal para<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem neuronal relativamente simples, usando técnicas de baixo custo. Aqui descrevemos imagem único neurônio dentro de animais adultos intactos usando codificados geneticamente indicadores de cálcio fluorescentes.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

in-vivo-neuronal-calcium-imaging-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

24.8K visualizações.  Boston University School of Medicine. Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e reagentes, C. elegans Faz um organismo modelo ideal para In vivo Imagem neuronal relativamente simples, usando técnicas de baixo custo. Aqui descrevemos imagem único neurônio dentro de animais adultos intactos usando codificados geneticamente indicadores de cálcio fluorescentes.

Vídeo: In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser axotomia em C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.