Induzindo a Formação de Retina Neural 3D a partir de Células-Tronco H9-Embrionárias Cultivadas para Terapias Baseadas em Células-Tronco

Para começar, descongelar e cultivar células-tronco embrionárias H9 em meio de manutenção contendo Y-27632. No dia zero, uma vez que as colônias se tornem 70% confluentes, lave-as com 2 mililitros de DPBS e, em seguida, incube as células com 0,5 mililitros de solução de dissociação celular contendo 20 micromoles por litro Y-27632. Para abortar a digestão, adicione 3 mililitros de meio de manutenção contendo 20 micromoles por litro Y-27632.

Para pellet as células, centrifugar o tubo a 190 G por cinco minutos e descartar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um mililitro de meio quimicamente definido livre de fator de crescimento com Y-27632. Depois de contar as células, adicione 1,2 milhão de células a 10 mililitros de meio quimicamente definido livre de fator de crescimento e misture bem.

Em seguida, distribua 100 microlitros de suspensão celular para cada poço de uma placa de fundo cônico de 96 poços. Incubar em uma atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono. Para induzir a formação de retina no sexto dia, adicione meio contendo BMP4 a cada poço de uma placa de fundo em V de 96 poços e incube novamente.

Nos dias nove, 12 e 15, substituir metade do meio gasto por meio fresco sem BMP4. No dia 18, transfira cuidadosamente os corpos embrionários formados para um tubo centrífugo de 15 mililitros. Após a precipitação natural dos corpos embrionários, remova suavemente o sobrenadante e lave-os com o meio de diferenciação da retina neural.

Em seguida, coloque os corpos embrionários em uma placa de seis poços de baixa absorção e incube a placa novamente. No dia 21, imagens de Brightfield mostraram estrutura neuroepitelial contínua na retina neural gerada por este método. A taxa de sucesso de indução retiniana foi significativamente maior e os organoides retinianos gerados usando este protocolo foram semelhantes em tamanho e morfologia em comparação com outros métodos.