Este protocolo descreve um método simples e eficiente de diferenciar CPIs humanas em organoides neurorretinianos tridimensionais complexos para pesquisa e aplicações regenerativas. Essa técnica envolve culturas aderentes e de suspensão, o que permite a coleta seletiva e o enriquecimento tanto dos organoides da retina quanto das células do FR. Ele pode oferecer um suprimento viável e regular de fontes celulares para o desenvolvimento de terapias baseadas em células para doenças degenerativas da retina.
Tais organoides da retina derivados de células-tronco e células RPE são úteis como modelos in vitro para estudar o desenvolvimento ocular e doenças hereditárias da retina. Este método pode ser facilmente replicado por laboratórios de pesquisa que já estão familiarizados com o manuseio de culturas humanas de IPSC. A demonstração visual apoia grandemente a identificação de campos oculares e o isolamento de copos neurorretinários com base em seu posicionamento espacial e características morfológicas.
Para começar, aspirar o meio gasto de 70 a 80% de culturas humanas de IPSC confluentes em placas de seis poços. Adicione PBS aos poços, gire-os e aspirar o tampão de lavagem. Em seguida, adicione um mililitro de solução de dissociação celular ou CDS a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por cinco a sete minutos até que as células se arredondam.
Aspirar o CDS e coletar a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Gire o tubo a 1.000 RPM por quatro minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1,2 mililitros do meio Essential 8.
Distribuir 200 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de seis poços revestida com matriz contendo 1,5 mililitros de meio de cultura IPSC e 10 micromolares Y27632. Após 12 a 24 horas, retirar o meio gasto e adicionar meio de ascensão completo pré-aquecido sem Y27632 para manter as culturas. Troque o meio de cultura a cada 24 horas até que as culturas atinjam 70 a 80% de confluência.
No dia zero, aspirar o meio de manutenção IPSC humano e adicionar um nanograma por mililitro BFGF e um nanograma por mililitro Noggin à placa de seis poços. Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%. No primeiro dia, aspirar o meio gasto e adicionar um meio de indução de diferenciação contendo um nanograma por mililitro BFGF e 10 nanogramas por mililitro Noggin.
Incube as células novamente a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%. Nos dias dois e três, retire o meio gasto e adicione o meio de indução de diferenciação contendo 10 nanogramas por mililitro de Noggin. Depois de adicionar dois mililitros por meio de poço a uma placa de seis poços, incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% e troque o meio a cada 24 horas.
No quarto dia, remova o meio gasto e adicione o meio de diferenciação retiniana ou RDM. Siga o mesmo procedimento para adicionar dois mililitros por poço médio a uma placa de seis poços e incubar as culturas. Mude o meio todos os dias.
Por volta dos dias 14 e 18, observar as culturas ao microscópio com aumento de 10X para o surgimento de domínios neurais semelhantes a rosetas constituídos por progenitores precoces do campo ocular. Por volta dos dias 21 e 28, observar as culturas ao microscópio em aumentos de 4X e 10X para observar a emergência de PFEs distintas auto-organizadas com uma ilha central de estruturas neurorretinianas circulares 3D cercadas por crescimentos contíguos de neuroepitélio e epitélio da superfície ocular. Pegue uma pipeta Pasteur estéril e segure a base em uma mão e a ponta capilar na outra.
Esterilizar a chama e aquecer a região próxima ao meio da ponta capilar com movimentos rotacionais até que o vidro fique maleável. Em seguida, afaste-se da chama e puxe rapidamente a ponta capilar para fora para criar uma ponta capilar fina com um lúmen fechado. Segure a ponta fina horizontalmente na frente da chama e passe-a rapidamente através da chama em um movimento para fora para criar um gancho liso ou uma ponta capilar em forma de L.
Sob um microscópio estéreo, escolha manualmente os copos neurorretinários bem formados dos EFPs individuais usando a zona de curvatura externa lisa do gancho capilar como uma colher fina. Nos dias 25 e 30, adicionar quatro mililitros de meio de diferenciação retiniana pré-aquecido em uma placa de baixa fixação de 60 milímetros para cultura e manter copos de retina para gerar organoides retinianos 3D. Isso deve ser feito antes de colher os copos neurorretinianos.
Coloque uma micropipeta de um milímetro para aspirar 100 microlitros e use micropontas de um mililitro com aberturas de furo largo para aspirar e transferir os copos de retina flutuantes para os pratos frescos de cultura de baixa aderência preparados anteriormente. Manter os copos da retina em RDM como culturas de suspensão não aderentes e incubá-los a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%. Nos dias 30 e 45, seguindo um método de alimentação parcial, retire metade do volume do meio gasto e substitua-o por um volume igual de meio fresco.
Nos dias 45 e 60, cultivar os organoides da retina por mais duas semanas em RDM contendo 100 taurina micromolar para apoiar melhor sobrevivência e diferenciação de linhagem de progenitores neurorretinários e o desenvolvimento de tipos de células retinianas maduras. Os organoides da retina são caracterizados em diferentes estágios de maturação para a expressão de vários marcadores progenitores da retina usando RT-PCR e imunohistoquímica. Os resultados da RT-PCR confirmaram a indução e expressão de marcadores neurorretinários em organoides retinianos com um mês de idade e organoides retinianos com dois meses de idade.
As imagens confocais de cortes imunomarcados de organoides imaturos da retina usando anticorpos contra os marcadores progenitores neurorretinários Chx10, PAX6 e Otx2, e organoides da retina madura usando anticorpos contra os marcadores precursores de fotorreceptores recuperamina e CRX são mostradas aqui. A camada mais externa marcada dos organoides da retina com células fotorreceptoras diferenciadoras é ampliada e mostrada nessas imagens. As extensões rudimentares em forma de segmento interno são marcadas por setas brancas.
Os agrupamentos de EFP com a taça neurorretiniana no centro e as excrescências migratórias de EPR mostram pigmentação ao longo das bordas dianteiras. Crescimentos epiteliais pigmentados bem diferenciados de múltiplas EFPs ao redor da ilha neurorretiniana são mostrados aqui. A maior magnificação de um PFE mostra a zona migratória dos progenitores do EPR e o epitélio da superfície ocular ao redor de uma taça neurorretiniana.
Culturas aderentes estendidas que desenvolveram monocamadas de células imaturas de EPR contendo células pigmentadas e não pigmentadas são mostradas aqui. Culturas de monocamadas de células RPE totalmente maduras e pigmentadas mostram morfologia de paralelepípedos aos 60 dias. As células RPE que expressam PAX6, MITF e RPE65 são mostradas nesta figura.
Essas imagens representam PFE com agregados anormais de progenitores da retina com laminação distorcida e ausência de estrias. O PFE com a taça neurorretiniana em miniatura, mas sem a zona circundante de EPR e o epitélio da superfície ocular são mostrados nesta figura. A imagem representativa mostra agregados neurorretinários irregulares formados na cultura em suspensão.
É muito crítico iniciar o processo de diferenciação usando culturas de crescimento quase confluente de IPCs para obter indução eficiente de campos oculares dentro de três a quatro semanas. Organoides da retina e células do EPR geradas a partir de IPCs normais e específicas do paciente podem ser usados como modelos de doenças retinianas e para testar novas drogas terapêuticas.
