Para começar, fixe um goniômetro de dois eixos com uma placa de titânio na placa de platina para posicionamento XY sob o microscópio. Ative o software de digitalização, defina os pixels para 512 por 512 bidirecional para ligado usando uma lente objetiva de 20X. Depois de realizar a cirurgia da janela craniana, coloque o filhote que expressa GCaMP em um lado do hemisfério na almofada de aquecimento.
Usando parafusos, prenda a barra de titânio de montagem da cabeça à placa de titânio. Em seguida, ajuste o ângulo da janela horizontalmente com o goniômetro. Ilumine a superfície do cérebro com a luz de fundo e selecione a área de imagem usando o posicionamento XY com uma lente objetiva 5X.
Sob uma lente de imersão em água 20X, administre colírios na janela craniana. Depois de desativar a luz de fundo, escaneie a superfície do cérebro no modo de um fóton. Aumente a intensidade do laser para visualizar a autofluorescência verde do vidro e da superfície do cérebro.
Cubra o microscópio para evitar interferência de luz externa. Inicie o software de digitalização para o modo de dois fótons para geração de imagens. Em seguida, calibre a potência do laser e o ganho do detector para visualizar de forma ideal os sinais GCaMP.
Localize a profundidade em uma área de imagem preenchida com muitos neurônios que expressam GCaMP e inicie a imagem de lapso de tempo para capturar sinais de GCaMP. A microscopia de dois fótons revelou atividades de neurônios da camada quatro no córtex do barril de um filhote pós-natal do sexto dia com fluorescência verde. O GCaMP verde foi mais proeminente, resultando em vazamento de sinal para o canal vermelho e identificação de 14 regiões de interesse.
