A azeitona inferior é a parte mais ventral da medula, e assim é extremamente difícil de alcançar em um animal vivo. Aqui, introduzimos um protocolo para expor o cérebro de camundongo adulto do lado ventral, e usamos lentes GRIN para registrar atividade neuronal nos neurônios inferiores de oliva expressando sensores de cálcio. Este método evita danos ao tronco cerebral crítico da vida, e permite investigações sobre padrões de atividade espaço-temporal e integração de entrada na azeitona inferior.
Uma vez que a operação é realizada na complexa região da garganta com muitas estruturas vitais, é essencial que seja conduzida por um pesquisador com habilidades cirúrgicas de alto nível. Prepare um tubo de intubação cortando uma fenda de 5 a 6 milímetros de comprimento e 0,8 milímetros de largura da ponta de um cateter de 20 bitolas. Prepare uma agulha cega e curva cortando a ponta, lixe a superfície da fratura e dobre-a com o plier.
Isso será usado para apoiar uma traqueia durante a traqueotomia. Diluir 15 miligramas por cetamina mililitro com soro fisiológico a 15% Montar ferramentas cirúrgicas e consumíveis. Coloque a almofada de aquecimento a 38 graus Celsius.
Gire o nariz 180 graus horizontalmente em quadro estereotaxic. Pesar o rato cuja azeitona inferior foi previamente transfeminada por GCaMP6s portadores de vírus, e calcular a quantidade de cetamina diluída para injeção. Caixa de indução de pré-preenchimento com isoflurane de 5%, e anestesiar o mouse.
Monte o mouse na estrutura estereotaxic, lado ventral para cima. Raspe a garganta do rato e a área da coxa. Remova o cabelo residual com creme de depilação.
Aplique geleia de xilocaine na pele da garganta. Monitore a temperatura do mouse com um sensor térmico retal. Injete um mililitro pré-aquecido intraperitonel.
Avalie a profundidade da anestesia com forte aperto nos dedos do pé traseiro. Nenhuma resposta detectável deve ser evocada. Faça uma incisão vertical na pele da garganta ao longo da linha média.
Separe a pele do pescoço das vísceras sob ela usando o método de dissecção sem corte e corte a pele. Glândulas salivares livres do tecido conjuntivo, e invertê-las lateralmente para expor a traqueia coberta de músculo estetoide. Injete intraperitoneal a primeira dose de cetamina diluída a cinco mililitros por quilograma de peso animal.
Divida cuidadosamente o músculo estetireóide ao longo da linha média com a ponta de um fórceps fino para expor a traqueia. Desprender traqueia de vasos sanguíneos e esôfago com fórceps usando método de dissecção contundente. Injete uma segunda dose de cetamina diluída a 2,5 mililitros por quilograma de peso animal.
Insira uma agulha sem cortes sob traqueia. Levante a traqueia com a agulha cega. Faça o fio de sutura dar a volta no terceiro anel de traqueia, caudal a glândula tireoide, com uma agulha de meio círculo.
Faça quatro laços de instrumentos neste anel. Fure a pele do peito com a mesma agulha de meio círculo e conduza a linha através da pele. Levante suavemente a traqueia com o fio, e corte a traquea caudal na glândula tireoide.
Puxe a traqueia em direção à pele do peito. Levante a abertura da traqueia adicionando um pequeno pedaço de esponja cirúrgica sob ela. Remova qualquer líquido restante dentro da ponta de abertura da traqueia com uma fina tira de tecido de limpeza.
Troque o fluxo isoflurane do nariz estereotaxico para o tubo de intubação. Insira o tubo de intubação na traqueia. Certifique-se de que parte da fenda no tubo permaneça fora da traqueia para permitir a respiração.
Fixar a traqueia na pele do peito do rato fazendo de três a quatro laços de instrumento. Amarre a traqueia com a rosca de sutura para fixar o tubo de intubação. Corte o músculo estetoide ao longo das fibras musculares com os fórceps finos.
Corte a parte isolada com a tesoura de mola. Livre cuidadosamente as sobras de traqueia e laringe do músculo para minimizar os danos nos vasos sanguíneos no músculo. Remova as sobras de traqueia e laringe.
Livre do esôfago do tecido conectado com fórceps e corte-o com uma tesoura de mola. Remova o músculo longitudinal que cobre o tronco cerebral e o arco ventral do atlas. Remova o músculo que cobre o arco ventral atlas e o tubérculo anterior.
Corte os arcos ventral do atlas com o rongeur. Remova o tubérculo anterior do atlas. Remova o sangue e o fluido para ver o forame magnum e o tronco cerebral.
Expanda o foramen magnum removendo o osso occipital com o rongeur. Remova a cartilagem e descasque cuidadosamente a camada periosteal da dura-maternidade com as fórceps finas para ter uma visão clara do tronco cerebral ventral. Aperte o sensor SpO2 na coxa do mouse para monitorar sinais vitais como frequência cardíaca, saturação de oxigênio e taxa de respiração.
Monte a lente GRIN na haste de implantação. Limpe a lente cuidadosamente com tecido de limpeza 70% encharcado de etanol. Fixar a haste de implantação na estrutura estereotaxic e montar o microscópio em miniatura na haste de implantação.
Adicione várias gotas de soro fisiológico na área do tronco cerebral para imersão das lentes GRIN. Aproxime-se do tronco cerebral com a lente GRIN. GCaMP6s expressando neurônios de oliva inferiores na área superficial podem ser encontrados em uma região em forma de retângulo, cerca de 0,5 a 1,7 milímetros rostral para o atlas restante, e cerca de 2,6 a 1,1 milímetros lateral para a linha média.
Ligue o LED azul excitação em microscópio em miniatura para localizar neurônios de oliva inferiores transfectados GCaMP6s. Os neurônios mostram diferentes intensidades de fluorescência de linha de base devido a vários níveis de expressão GCaMP6s. A mudança do nível de cálcio do neurônio de oliva inferior circulado somata no vídeo à esquerda nos mostrará delta F dividido por traços F à direita.
Embora o rato seja mantido aquecido e hidratado, ele inevitavelmente será enfraquecido por anestesia prolongada e cirurgia. É essencial manter a duração da cirurgia curta para que a condição física do rato seja boa para a gravação. Um pesquisador qualificado pode terminar a cirurgia em 70 minutos.
Este método, com modificações, pode ser usado para estudar outras regiões adjacentes do tronco cerebral ventral.
