Prepare-se para a imagem usando um microscópio confocal dois dias após a transfecção dos neurônios primários do hipocampo. Aqueça o acessório da câmara celular viva 60x subjetivo e o óleo da lente a 37 graus Celsius e equilibre a câmara a 5% de CO2. Usando as oculares, identifique os neurônios transfectados no canal que contém a proteína de carga.
Em seguida, clique em varredura para obter imagens dos neurônios e identificar o segmento inicial do axônio do canal SCI-5. Defina o campo de visão para uma caixa retangular de 32 por 128 pixels e mova-a para criar uma imagem de uma região do axônio, 50 a 150 mícrons distal ao segmento inicial do axônio. Registre a direcionalidade do transporte de carga e a orientação do ROI e pressione salvar como para salvá-lo como arquivo.
Observe que os pontos na caixa aparecerão na parte superior e direita nas imagens subsequentes. Registre o lado da imagem mais próximo do corpo celular e o lado mais próximo do terminal do axônio para garantir a orientação correta da polilinha do comagrafo. Defina a potência do laser 561 para 1,40, o orifício para 7,8, o tamanho para 128 pixels quadrados e a velocidade para 32 quadros por segundo.
Ajuste o ganho para visualizar o transporte de vesículas de carga individuais sem ser obscurecido pelo sinal de fundo. Selecione desenhar ROI retangular no menu suspenso ROI e desenhe o ROI para que ele cubra todo o campo de visão. Em seguida, clique com o botão direito e selecione usar como estimulação ROI S1. Em seguida, na guia de configuração ND, clique em adquirir imagem para coletar a imagem de referência de pré-estimulação.
Em seguida, defina a estimulação para ROI S1, intervalo para sem atraso, duração de 1,64 segundos e loops para sete. Em seguida, clique em adquirir imagem para coletar a imagem de referência pós-estimulação. Selecione esperando, sem aquisição, dois minutos para fornecer um período de recuperação para carga fluorescente para repovoar o ROI branqueado.
Selecione o intervalo de aquisição, sem atraso, duração de cinco minutos, loops, 8, 615. Clique no botão aplicar configurações de estimulação na guia de configuração ND, seguido de executar agora. Colete também vídeos de transporte de dois neurônios para análise.
Redefina o campo de visão para toda a imagem e, em seguida, colete uma imagem do neurônio completo nos canais 561 e 647 com a caixa ROI incluída. Registre as coordenadas XY onde a imagem foi tirada para confirmação pós-fixação da expressão da proteína. A imagem de células vivas de um neurônio transfectado expressando a sinaptofisina da proteína de carga mAPL foi realizada usando este protocolo.
O domínio externo da neuro fasina no segmento inicial do axônio também foi rotulado. A imagem do transporte de carga foi realizada na região axonal de interesse. Outras análises de imunofluorescência pós-imagem confirmaram a co-expressão da proteína tau e mAPL Sinaptofisina.
