Comece dissecando o hipocampo de um cérebro embrionário de camundongo e coloque o tecido dissecado em tampão gelado sem cálcio e magnésio ou CMF. Em seguida, remova o CMF e enxágue o tecido quatro vezes com CMF fresco e frio, girando o tubo suavemente entre os enxágues. Em seguida, adicione a solução filtrada de tripsina a 0,125% e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius, girando a cada cinco minutos.
Após a incubação, remova a solução de tripsina e lave duas vezes com CMF gelado. Em seguida, adicione três mililitros de solução de inativação de tripsina. Em seguida, para dissociar as células, titular 30 vezes usando dois segundos de empate com uma agulha de calibre 14 presa a uma seringa de três mililitros.
Continue a titulação com dois segundos 30 vezes usando uma agulha de calibre 15, depois 20 vezes usando uma agulha de calibre 16, seguidas de 20 vezes com uma agulha de calibre 18. Em seguida, execute três segundos usando uma agulha de calibre 21 15 vezes para completar a dissociação celular. Verifique se há aglomerados de células colocando uma gota da suspensão celular em uma lâmina de microscópio.
Em seguida, filtre cinco mililitros de FBS usando um filtro de seringa de 0,22 mícron. Coloque suavemente a suspensão celular no FBS em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células a 200 x g a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Remova o FBS e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio neurobasal quente sem antibióticos. Diluir a suspensão celular em azul de tripano a 0,4% e obter uma contagem de células. Coloque as células em 750 microlitros de meio neurobasal livre de antibióticos em uma lâmina de câmara de 4 poços revestida com poli-D-lisina pré-aquecida.
Incube as células em uma câmara com umidade controlada a 37 graus Celsius e 5% de CO2.
