Подготовьтесь к визуализации с помощью конфокального микроскопа через два дня после трансфекции первичных нейронов гиппокампа. Нагрейте насадку камеры живых клеток в 60 раз больше субъективного и масло для линз до 37 градусов Цельсия и уравновесьте камеру до 5% CO2. С помощью окуляров определите трансфицированные нейроны в канале, содержащем карго-белок.
Затем нажмите кнопку «Сканировать», чтобы получить изображение нейронов и определить начальный сегмент аксона канала SCI-5. Установите поле зрения на прямоугольное поле размером 32 на 128 пикселей и переместите его, чтобы отобразить область аксона, расположенную на расстоянии от 50 до 150 микрон дистальнее начального сегмента аксона. Запишите направленность грузового транспорта и ориентацию ROI, затем нажмите «Сохранить как», чтобы сохранить его как файл.
Обратите внимание, что точки на коробке будут отображаться вверху и справа на последующих изображениях. Запишите сторону изображения, ближайшую к телу ячейки, и сторону, ближайшую к концу аксона, чтобы обеспечить правильную ориентацию полилинии комаграфа. Установите мощность лазера 561 на 1,40, отверстие на 7,8, размер на 128 пикселей в квадрате и скорость на 32 кадра в секунду.
Отрегулируйте усиление, чтобы визуализировать транспортировку отдельных грузовых везикул, не загораживаясь фоновым сигналом. Выберите «Нарисовать прямоугольный ROI» в раскрывающемся меню «ROI» и нарисуйте ROI так, чтобы он покрывал все поле зрения. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите использовать в качестве стимуляции ROI S1. Затем на вкладке «Настройка ND» нажмите «Получить изображение», чтобы получить эталонное изображение для предварительной стимуляции.
Затем установите стимуляцию на ROI S1, интервал на отсутствие задержки, продолжительность 1,64 секунды и циклы на семь. Затем нажмите на «Получить изображение», чтобы получить справочное изображение после стимуляции. Выберите ожидание, без захвата, две минуты, чтобы обеспечить период восстановления для флуоресцентного груза, чтобы повторно заполнить обесцвеченную рентабельность инвестиций.
Выберите интервал захвата, без задержки, продолжительность пять минут, циклы, 8, 615. Нажмите кнопку «Применить настройки стимуляции» на вкладке «Настройка ND», а затем выберите «Запустить сейчас». Также соберите транспортные видео с двух нейронов для анализа.
Сбросьте поле зрения на все изображение, а затем соберите изображение всего нейрона в каналах 561 и 647 с включенным блоком ROI. Запишите координаты XY, где был сделан снимок, для постфиксационного подтверждения экспрессии белка. Визуализация живых клеток трансфицированного нейрона, экспрессирующего грузовой белок синаптофизин mAPL, была выполнена с использованием этого протокола.
Также был помечен внешний домен нейрофазина в начальном сегменте Axon. Визуализация грузового транспорта проводилась в интересующей аксональной области. Дальнейший иммунофлуоресцентный анализ после визуализации подтвердил совместную экспрессию тау-белка и mAPL Synaptophysin.
