Isolamento e preparação de suspensão esplênica de célula única de camundongos para análise de citometria de fluxo

Para começar, coloque o camundongo sacrificado em decúbito dorsal na bancada limpa. Corte ao longo da linha média do abdômen do camundongo e separe as estruturas abdominais camada por camada. Usando uma pinça, abra suavemente o omento maior e o estômago.

Em seguida, puxe suavemente o baço com o ligamento gastroesplênico e separe-o dos tecidos e ligamentos circundantes para obter um baço intacto. Coloque um filtro de células de 70 mícrons em uma placa de cultura estéril de 100 milímetros. Adicione o baço ao filtro de células e esmague-o com um êmbolo de seringa.

Adicione cinco a oito mililitros de fluido de lavagem homogeneizado para empurrar as células esplênicas através do filtro para a placa de cultura. Centrifugar o filtrado a 450 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet com o diluente de amostra fornecido com o kit de separação de linfócitos.

Depois de contar as células em um hemocitômetro, ajuste a concentração celular para 2 X 10 elevado a oito células por mililitro. Em um tubo de centrífuga, tome a mesma quantidade de solução de separação de linfócitos que a suspensão de célula única de tecido. Pipetar cuidadosamente a suspensão monocelular para a superfície da solução de separação de linfócitos e centrifugar a 800 g durante 30 minutos a 25 graus Celsius.

Após a centrifugação, observe as quatro camadas do tubo de cima para baixo. Usando uma pipeta, puxe cuidadosamente a camada de linfócitos brancos leitosos anulares para outro tubo. Adicione 10 mililitros de solução de limpeza ao tubo para misturar as células.

Centrifugue a suspensão celular a 250g por cinco minutos. Rejeitar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet em 10 mililitros de meio RPMI 1640 para contagem de células.