Preparação de amostras de sangue total para citometria de fluxo e análise de citocinas para determinar a imunidade do hospedeiro antígeno-específica a patógenos fúngicos e virais

Para iniciar a preparação da amostra para citometria de fluxo, retire da incubadora tubos de estimulação contendo amostras de sangue total com Brefeldina A. Adicione 500 microlitros de solução de EDTA 0,5 molar a cada tubo de estimulação contendo Brefeldin A.Transfira as amostras para novos tubos de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, pipete um mililitro de tampão de lise eritrocitária em cada tubo de estimulação para enxaguá-lo.

Transfira o tampão e a suspensão da célula para o mesmo tubo de centrífuga. Centrifugar os tubos a 600 g durante sete minutos e pipetar cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, adicione tampão de lise eritrocitária ao pellet e ressuspenda-o.

Incubar as amostras à temperatura ambiente até que pareçam límpidas ou durante um máximo de seis minutos. Centrifugar os tubos a 600 g durante sete minutos. Depois de descartar o sobrenadante, adicione um mililitro de HBSS ao pellet.

Transfira a suspensão celular para tubos de reação de dois mililitros. Em seguida, centrifugue os tubos a 400 g durante cinco minutos. Rejeitar o sobrenadante antes de efectuar a coloração por citometria de fluxo.

Transfira as amostras dos tubos de estimulação que não contêm Brefeldin A para tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos a 2 000 g durante 20 minutos. Agora pipete cuidadosamente o sobrenadante em um tubo novo de 1,5 mililitro.

Se não analisar o sobrenadante imediatamente, criopreserve a amostra a 80 graus Celsius. Ao usar amostras congeladas, centrifugue sobrenadantes descongelados novamente a uma velocidade superior a 7.000 g por cinco minutos antes da análise. Realize a pré-diluição das amostras conforme exigido pelo protocolo de ensaio de citocinas.

Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de proteção de RNA. Criopreservá-lo a 80 graus Celsius para posterior isolamento de RNA. Alternativamente, ressuspenda o pellet celular em 700 microlitros de tampão de lise para isolamento imediato do RNA.