Os autores gostariam de agradecer os participantes do estudo e seus pais. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canadá) para o acesso ao seu leitor ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov para análise estatística, e Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois e Martine Caty para especialista técnico assistência. Apoiada por doações de le Fonds d&#39;opération pour les Projets de Recherche et d&#39;Clinique des evalution tecnologias (CHU Sainte-Justine) para HS e PO, por la Fondation Centre de Cancerologie Charles-Bruneau, e pelo Leukemia &amp; Lymphoma Society of Canadá. ISF foi apoiado por bolsas de estudo de la Fondation CHU Sainte-Justine e le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG foi o destinatário de bolsas de estudo do Departamento de Microbiologia, Imunologia &amp; Infecciologia, Université de Montréal (Gabriel-Marquês de Bolsas de Estudo), FRQS, e do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). NM foi apoiado por la Fondation CHU Sainte-Justine, a Fundação Cole, e FRQS.

Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética Ética em Pesquisa do CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, no Canadá, onde o estudo foi realizado. O consentimento informado foi procurado e obtido de todos os participantes do estudo, seus pais ou responsáveis ​​legais. Todos os procedimentos realizados nos dias 1 e 2 deve ser realizado sob condições estéreis (isto é, sob uma câmara de fluxo laminar). Procedimentos de segurança padrão para o manuseio de sangue humano devem ser estritamente observados. 1. O revestimento das placas <ol><li> Permeabilizar o difluoreto de polivinilideno (PVDF) de membranas na parte inferior de 96 poços placas ELISpot branco MultiScreen IP, adicionando a cada poço 20 ul de etanol a 35% durante 1 min. Membranas deve tornar-se um pouco translúcido. </li><li> Imediatamente lavar os poços 3 vezes com 200 ul de 1x tampão fosfato salino (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) utilizando uma multichannel pipeta ou dispositivo semelhante. Esta etapa é fundamental, uma vez que os resíduos de álcool pode afetar a viabilidade celular e ligação do anticorpo de captura. Placas ELISpot são frágeis e devem ser manuseados com cuidado: não é recomendado o uso de uma placa de lavadora automática. </li><li> O revestimento das cavidades com 10 pi de rato purificada anticorpo anti-humano de captura de IFN-γ diluída em 1x PBS para uma concentração final de 10 ug / ml. Cubra as placas com filme plástico regular e incubar durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 2. Bloqueio placas <ol><li> Esvaziar os poços, batendo-os secar e lavar placas 5 vezes com 200 mL de PBS 1x. </li><li> Encha as cavidades com 200 ul de meio completo RPMI 1640 e incubar as placas durante 2 horas a 37 ° C (passo de bloqueio). </li><li> Lavar as placas 5 vezes com 200 ul de PBS 1x e manter os poços cheios de PBS 1x até que as células estão prontas a ser revestida. </li></ol> 3. Celular chapeamento e Estimulação <ol><li> Prepare pAs células mononucleares do sangue eripheral (PBMC) a partir de amostras de sangue venoso humano por centrifugação em gradientes de Ficoll-Paque, utilizando procedimentos padrão. Alternativamente, usando métodos padrão, descongelar alíquotas de PBMC congelados em azoto líquido. Após centrifugação os últimos, ressuspender as células em uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml e incubar durante a noite a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água. </li><li> Retirar CMSP da incubadora e ressuspender-los em um volume final de 5 ml de meio completo de RPMI 1640. </li><li> Incubar de PBMC na presença de 10 ul de endonuclease de engenharia genética a partir de Serratia marcescens, durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Retirar uma aliquota de 50 ul de PBMC e misturar-se com 50 ul de corante azul de tripano. Contar as células e avaliar a viabilidade% utilizando um hemocitómetro e exame microscópico (método de exclusão de corante). Vários métodos automatizados para contagem de células e avaliação da viabilidade celular pode alentão ser utilizado. PBMC deve ser&gt; 95% viáveis. Descartar amostra quando a viabilidade for inferior a 95%. </li><li> Centrífuga PBMC a 700 xg durante 5 min, o sobrenadante de descarte, e ressuspender as células em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (HIS) a uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml. Manter a 37 ° C até que as misturas de estimulação são adicionados à placa. </li><li> Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, 100 uL da mistura de estimulação adequado. Três misturas de estimulação devem ser utilizados como descrito abaixo: <ol><li> Utilização meio de AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (IHS) como controlo negativo. </li><li> Use anticorpo monoclonal anti-CD3 (clone OKT3), diluída em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS para uma concentração final de 0,5 ug / ml como controlo positivo). </li><li> Use antigénio VZV, sob a forma de um ou outro irradiadas-γ (10.000 Gy, 30 min de tempo de exposição) vivo atenuado da vacina de VZV (unidades formadoras de placa 1350 UFP [] / ml) diluiçãoted a 1:200 em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS) ou 1 ug de uma mistura equimolar de 67 péptidos (15 resíduos de aminoácidos) sintetizados com base na sequência do VZV imediatamente precoce (IE63) fosfoproteína . Controlar a eficácia da irradiação por monitorização da ausência de sinais visíveis de efeitos citopáticos após 4 dias em culturas de CMSP. </li><li> Prepare todos os poços em duplicado. </li></ol></li><li> Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, a 100 ul de células preparado no passo 5.4 aos poços apropriados. Dois poços devem ser deixados sem células (controle negativo). Incubar durante 20 horas a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água. Não agite, mover ou empilhar as placas em cima uns dos outros durante a incubação. </li></ol> 4. Ponto de Desenvolvimento e Detecção <ol><li> Descartar as células e lava-se as placas 10 vezes com 1x de PBS suplementado com 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 ajuda a separar as células que aderiram ao PVDF membrane após incubação durante a noite. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 100 ul de 0,5 mg / ml biotina conjugado anticorpo monoclonal anti-IFN-γ (clone 4S.B3) diluído em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA). Incubar as placas durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os poços 6x com PBST e adiciona cada poço 100 ul de estreptavidina conjugatd com fosfatase alcalina diluído 1:1000 em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de BSA. Cobrir as placas e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as placas 3x com PBST e 3x com PBS 1x. Adicionar 100 ul de um fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) nitro solução de substrato / azul de cloreto de tetrazólio (NBT) e incuba-se 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as placas com água corrente destilada. Retirar a parte inferior da placa de ELISpot e lavar ambos os lados da membrana, com água destilada. Air secar os pratos. </li><li> Examinar os poços e enumerar os pontos usando um d estereoscópicomicroscópio issection ou digitalizar as placas utilizando um contador local automatizado. Mantenha as placas ao abrigo da luz, se não podem ser examinados no mesmo dia. <ol><li> Calcule a média dos números de pontos contados em poços em duplicado correspondentes e subtrai o número de manchas contadas nos poços de controlo negativo (ausência de células) a partir do número de pontos contados em poços de teste. </li><li> Expressar a produção de IFN-γ como o número de unidades formadoras de mancha (SFU) por 10 6 PBMC. </li><li> Considere-se que as amostras de teste é positivo se o número de SFU é&gt; 50 por 10 6 PBMC e dois desvios padrão (DP) acima do controlo negativo (meio de células + AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS). </li><li> Use um valor de 400 SFU por bem quando os pontos são numerosas demais para serem contados. </li></ol></li><li> Teste se os dados ELISpot são normalmente distribuídos ou não pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Quando os dados são normalmente distribuídos, realizar comparações estatísticas utilizando tes t de Studentt (2 grupos) ou ANOVA e pós-teste de Bonferroni (comparações múltiplas). Se os dados não são normalmente distribuídos, use o teste de Mann-Whitney (2 grupos) ou Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn (comparações múltiplas). </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Modificações e resolução de problemas: ensaios de IFN-γ ELISpot têm sido usados ​​para avaliar as respostas imunes mediadas por células dirigidas contra uma variedade de agentes patogénicos microbianos, incluindo o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) 24,25, vírus da hepatite C (HCV), 26, 27, e Mycobacterium tuberculosis 28,29, só para citar alguns. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um ensaio ELISPOT IFN-γ para medir a imunidade celular contr...

Primeiro realizada em 1989, UCBT é cada vez mais utilizado como parte do tratamento de várias doenças do sangue neoplásicas e não-neoplásicas em crianças 1. VZV é um alphaherpesvirus humano citopático que causa duas doenças diferentes, varicela (após a infecção primária) e herpes zoster (após reativação). Após a infecção primária, VZV persiste durante toda a vida do hospedeiro abrigada dentro de nervos sensoriais dos gânglios da raiz dorsal. Uma das complicações infecciosas mais ameaçadores seguintes UCBT está associada com VZV 2-4. No nosso centro clínico, na ausência de VZV profilaxia, a incidência cumulativa de doença VZV VZV doença em 3 anos foi de 46% postUCBT 2. Nesses pacientes, a infecção de novo com ou reativação do VZV é freqüentemente associada com a disseminação visceral para o sistema nervoso central, pulmões e fígado 5-7. Como resultado, o aciclovir, o valaciclovir ou famciclovir profilaxia é vulgarmente administrada em UBDestinatários CT 8,9. No entanto, esta estratégia de tratamento não ter em conta o potencial protector dos linfócitos T específicos de VZV ou a cinética de reconstituição de VZV respostas de células T específicas. Os problemas potenciais associados com o uso crescente de profilaxia anti-herpéticas longo prazo incluem a) overtreatment paciente; b) o desenvolvimento de resistência ao medicamento antiviral 10,11; e c) diminuição da VZV reconstituição imune específica 12,13. Como a detecção de VZV linfócitos T específicos funcionais correlaciona-se com a presença de proteção a longo prazo contra a infecção VZV e melhor evolução clínica 4,14,15, monitoramento mediadas por células respostas imunes dirigidas contra VZV durante o período pós-transplante pode resultar em um uso mais racional de antiviral tratamento, permitindo que os médicos a distinguir os pacientes que se beneficiariam de VZV profilaxia daqueles cujo sistema imunológico é capaz de controlar a replicação VZV 4,13. O ensaio ELISPOT de IFN-γ é amplamente utilizado para a monitorização de células de respostas imunes mediadas por uma variedade de sistemas experimentais e condições clínicas. Pontos são gerados após a clivagem de um substrato cromogénico, gerando um precipitado visível e estável no local da reacção. Cada foco individual representa, assim, a presença de uma célula produtora de citoquina indivíduo. IFN-γ ELISpot não só mede a capacidade das células individuais ex vivo para a produção de IFN-γ em resposta à estimulação in vitro com antigénio relacionado, mas também fornece uma estimativa da frequência de resposta de células numa determinada população celular 16,17. Para além da sua elevada sensibilidade, o IFN-γ ELISpot é simples de realizar, tornando possível a sua utilização no âmbito dos protocolos clínicos personalizados destinados a orientar a iniciação ou paragem do tratamento anti-viral. O procedimento detalhado abaixo descrevendoes um ensaio ELISPOT que é projetado especificamente para detectar e medir a produção de IFN-γ pelas células mononucleares do sangue periférico após estimulação in vitro com antígenos VZV derivados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

A varicela zoster (VZV) é uma importante causa de morbidade e mortalidade após um transplante de sangue do cordão umbilical (UCBT). Por esta razão, a profilaxia anti-herpética é administrado sistematicamente aos destinatários UCBT pediátricas para prevenir as complicações associadas à infecção por VZV, mas não há evidência com base consenso forte, que define a sua duração óptima. Porque a imunidade mediada por células T é responsável pelo controlo de infecção VZV, avaliando a reconstituição de VZV respostas de células T específicas a seguir UCBT poderia fornecer indicações quanto ao facto de a profilaxia deve ser mantido ou pode ser descontinuado. Para este fim, um interferão gama específica de VZV (IFN-γ) enzyme-linked immunospot (ELISPOT) foi desenvolvido para caracterizar a produção de IFN-γ por linfócitos T em resposta à estimulação in vitro com uma vacina de VZV vivo atenuado irradiado. Este ensaio proporciona uma medição rápida, reprodutível e sensível de VZV c específicaell imunidade mediada adequado para o monitoramento da reconstituição da imunidade específica VZV em um ambiente clínico e avaliar a capacidade de resposta imunitária a antigénios VZV.

O protocolo de ELISpot de IFN-γ detalhado acima, foi desenvolvido e optimizado no nosso laboratório para medir a magnitude e a qualidade das respostas celulares imunes mediadas dirigidos contra VZV 4. Várias fontes de antigénio VZV pode ser utilizado para o passo de estimulação. Estes incluem: a) detergentes comercialmente disponíveis extratos inativadas de VZV infectadas células Vero 18; b) piscinas de sobreposição de peptídeos sintéticos a partir de proteínas codificadas VZV específ...

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Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

15.5K visualizações.  Université de Montréal.  Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV). 

Vídeo: Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Imunologia e Infecção

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...