Para começar, incorpore a larva transgênica em agarose de baixo ponto de fusão em uma placa de micropoços com fundo de vidro. Coloque o prato no microscópico stage no microscópio invertido. Posicione e foque a região desejada para ablação no centro do campo de visão.
Escolha as configurações da pilha Z para criar imagens de toda a largura do opercle. Imagem da área de interesse do opérculo antes da ablação. Em seguida, desenhe uma região circular com um diâmetro de 25 micrômetros em um plano 2D selecionado.
Concentre-se no opercle usando a região de interesse ou a ferramenta ROI. Para realizar a ablação, aplique a potência de ablação medida sem objetivo a 450 miliwatts por um período de 10 segundos. Exponha a área selecionada ao laser de dois fótons.
Após a ablação, confirme a ablação estruturalmente criando imagens da mesma pilha Z com as mesmas configurações, conforme usado antes da ablação. Usando uma pinça ou uma agulha de dissecação, remova as larvas cuidadosamente da agarose de baixo ponto de fusão. Primeiro, remova uma camada de agarose que cobre as larvas.
Em segundo lugar, remova a agarose em contato direto com as larvas. Coloque as larvas de volta em um prato com mídia E3 pura. Quatro ou seis horas após a lesão, refaça a imagem da área do opérculo usando larvas embebidas em agarose nas mesmas configurações no mesmo microscópio.
Depois de processar as imagens em Fiji, quantifique as células com um rótulo nuclear ou medindo a área, caso as células estejam sobrepostas. Para quantificar a área, crie uma máscara abrangendo os macrófagos. Use a ferramenta Imagem, Ajustar, Limiar, Crie um ROI e analise as partículas.
Em seguida, meça a área. Gere gráficos traçando os resultados da medição usando um software adequado. Um acúmulo significativo de macrófagos na região do opérculo ablacionado foi detectado seis horas após a ablação em larvas seis dias após a fertilização.
Nas larvas quatro dias após a fertilização, o número de macrófagos aumentou quatro horas após a lesão. O número e a área de macrófagos aumentaram quatro horas após a lesão em comparação com o estado não ablacionado.
