We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense &#8211; USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.

Peixe-zebra (nácar cepa) foram nascidos e criados de acordo com os protocolos estabelecidos. Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento, usando tricaina 0,4 mM para anestesia e tricaina 1 mM para a eutanásia. Embriões de peixes-zebra e larvas foram tratadas em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como aprovado pela comissão competente (Laboratório Biológico MDI animais núcleo número IACUC 13-20). Este estudo foi aprovado pelo Instituto de Pesquisa do Genoma Humano Animal Care e Use Comitê Nacional, MDIBL Institucional Assurance # A-3562-01 sob o protocolo nº 14-09. Nota: O procedimento de imagiologia que capta a regeneração da barbatana no peixe-zebra larval é resumido nas seguintes etapas: 1. Criação de peixe-zebra para estágios larvais <ol><li> Recolher os ovos e coloque cerca de 50 ovos em um prato 100 x 25 mm Petri contendo 0,03% de sal Instant Ocean em água deionizada suplementado com 0,00004% de azul de metileno. Incubar O / N em uma incubadora de 28,5 ° C. </li> &lt;li&gt; Na manhã seguinte, retire os embriões mortos com uma pipeta de vidro e lave os ovos em uma peneira com 0,03% de sal Instant Ocean em água deionizada (médio embrião denominado). Nota: Média de Ringer como 18, 18 de Hanks, 19 E2, E3 20, e Danieau 21 pode ser preferido. </li><li> sup&gt; Adicionar meio embriões frescos para o prato. Se utilizando estirpes pigmentadas, adicionar opcionalmente 0,2 mM de 1-fenil-2-tioureia (PTU), como propiltiouracil irá impedir a melanogénese e, assim, a pigmentação das larvas. Deixe os embriões desenvolver na incubadora até a fertilização dois dias post ou qualquer outra fase larval desejado. </li></ol> 2. Preparação da câmara de imagem <ol><li> Método 1: câmaras de imagem feitos de PVC ou tubagem de Teflon (Figura 1) Nota: Este método é semelhante ao Concha e Adams (1998) 22. <ol><li> Adquirir plástico grau de água potável ou tubo Teflon de uma loja de hardware com um 25 milímetros um exteriorDA 20 mm de diâmetro interior. Cortar o tubo para fazer anéis de aproximadamente 10 mm de espessura, com uma superfície uniforme de cada lado. Use&gt; 200 lixa para suavizar as bordas. </li><li> Limpe os anéis com água morna e 70% de etanol e deixe-os secar ao ar. </li><li> Com uma ponta de pipeta, aplique graxa de silicone para a metade de um anel e anexar o anel para a 75 milímetros x 25 mm deslizamento tampa de vidro. Como alternativa, use uma seringa de 3 ml preenchido com graxa de silicone em vez de uma ponteira. Nota: Porque é difícil de inserir a massa de silicone para dentro da seringa de 3 ml, adicionar a gordura de silicone para uma seringa de 30 ml primeiro e usar esta para encher a seringa de 3 ml. </li></ol></li><li> Método 2: Preparação de uma placa de Petri como uma câmara de imagem. <ol><li> Adquirir 35 ou 60 mm de diâmetro de placas de Petri com uma lamela de vidro fixada na tampa (Figura 2A). Em alternativa, como mostrado na Figura 3 de Distel &amp; Koester (2007) 23, perfurar uma abertura suficientemente pequeno para huma lamela de idade na tampa de uma pequena placa de Petri e aplicar gordura de silicone para o exterior com uma seringa de 3 ml. Utilizando uma ponta de pipeta limpa, cuidadosamente anexar uma forma redonda ou quadrada lamela da espessura desejada para o exterior (Figura 2B). </li></ol></li><li> Para garantir que a agarose sendo usado para a montagem mantém firmemente ligado durante o procedimento de imagem, coloque uma malha de plástico fino dentro do ringue. Em primeiro lugar, cortar a malha feita de tela de janela obtidos a partir de uma loja de hardware, no tamanho do diâmetro do anel interior, utilizando uma tesoura fina com um ângulo. Em seguida, corte um pequeno rectângulo&gt; duas vezes o tamanho da larva para o meio da malha (Figura 1, 2). </li><li> Aplicar quatro pequenos pontos de gordura de silicone não-tóxico para a interface entre a cobertura de vidro e o anel de câmara (Figura 1A). </li><li> Use uma pinça para ligar a malha firmemente a parte inferior da lamela de vidro. </li></ol> 3. Montagem e imagem do Pré-injured Larva (este passo é opcional) Nota: Esta etapa é apropriado para comparações entre o comprimento da nadadeira amputada e regenerado, como o plano de amputação após a regeneração fin não é reconhecível em larvas do peixe. <ol><li> Prepara-se uma solução de agarose a 0,5-1,2% de baixo ponto de fusão em forma embrião para a imobilização do espécime. </li><li> Aquecer a agarose, num forno de microondas e transferir o líquido de agarose em tubos de 1,5 ml que são pré-aquecidas a 42 ° C num bloco de aquecimento. </li><li> Deixe a agarose quente arrefecer para 42 ° C, que pode ser mantida ao longo de várias semanas a esta temperatura. Tente evitar a pipetagem as larvas em agarose acima de 42 ° C, pois isso será prejudicial para os animais. </li><li> Anestesiar várias larvas usando 10 ml de tricaina 0,4 mM (pH 7) em forma de embriões em uma placa de Petri de diâmetro de 60 mm. Prepare o tricaina de acordo com as Receitas Livro Zebrafish 18. <ol><li> Em alternativa, utilizar 10 ml de uma diluição de 1: 1000 99% 2-fenoxietanol em uma placa de Petri de diâmetro de 60 mm. Pique as larvas com uma ponta microloader pipeta tampada, para avaliar a sua resposta ao toque antes de prosseguir. Use apenas larvas não-responsivos. </li></ol></li><li> Transferir uma larva na solução de agarose a 42 ° C utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro. Não transferir o líquido excessivo no agarose, caso contrário, a agarose será muito diluída e não solidificar. </li><li> Descartar o líquido restante a pipeta de transferência e a larva com uma gota de agarose numa pequena placa de Petri (35 ou 60 mm de diâmetro). Posicione a larva em seu lado para geração de imagens da barbatana caudal. </li><li> Permitir que a agarose solidificar. Avaliar a agarose com uma ponta de pipeta de plástico; a ponta vai mergulhar no agarose, se for muito líquido. Uma vez que a agarose solidificou, um pequeno recuo será visível ao tocar com a ponta da pipeta. Após a solidificação, adicionar solução tricaina e siga para o microscópio estereoscópico que será usada mais tarde para geração de imagens de lapso de tempo. <li> Use um microscópio estereoscópico com software time-lapse. Selecione um objectivo adequado e ampliação, que será utilizado mais tarde para imagens de lapso de tempo. Aqui, use um 3,5 x 16 milímetros, objectiva de distância trabalhando em um microscópio estereoscópico. Como desejado, utilizar microscópios alternativos e lentes objetivas, mas escolher uma ampliação adequada para explicar potencial xy-drift e crescimento da barbatana durante o procedimento de imagem. </li><li> Escolha do modo de detecção de câmara no microscópio. </li><li> No software, selecione o modo &quot;ao vivo&quot; para visualizar a larva na tela. </li><li> Abra a janela &quot;Propriedades&quot; para detectar automaticamente o brilho. </li><li> Ajustar manualmente o contraste ao microscópio base de trans-iluminação. </li><li> Mova a larva para fora do campo de visão e selecione o recurso Correção Shading para minimizar fundo nãoise. </li><li> Posicione a larva de volta para o campo de visão e tirar uma foto. Salve a imagem. </li><li> Retire a agarose da larva pela primeira raspando a agarose fora da cabeça. Desta forma, a larva pode ser deslizado para fora da agarose, puxando levemente a cabeça longe do restante agarose com uma ponta microloader pipeta tampado ou um pino de insetos. </li><li> Com uma pipeta de Pasteur de vidro transferir a larva em solução tricaina fresco. </li></ol> 4. Amputação Assay <ol><li> Prepare uma solução de agarose a 1,5%, utilizando meio de embrião e despeje uma camada fina em uma placa de Petri. Deixe o agarose solidificar. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, coloque o sideward larva para a agarose solidificada e amputar a nadadeira caudal com uma agulha de seringa de 23 G com uma ligeira pressão (Figura 3A). </li></ol> 5. Montagem da Larva para tempo-lapso <ol><li> Proceder como descrito nos passos 3,1-3,5 (Figura 3B). </li><li&gt; Transferir uma gota de 0,5-1,2% de agarose líquido a 42 ° C contendo a larva no anel câmara de imagem (passo 2.1), orientar a larva e deixar solidificar a agarose. Encha o anel com solução tricaina. Alternativamente, se a câmara de caixa de Petri (passo 2.2), é utilizada, para montar a larva da lamela tampa e preencher a tampa com solução tricaina. </li><li> Para permitir a cicatrização adequada ou regeneração de tecidos a ocorrer, com cuidado raspar a agarose em torno da barbatana caudal distal utilizando uma ponta microloader pipeta tampado ou um pino de insetos. Tente não ferir o fin repetidamente (Figura 3C). </li><li> Decantar a solução tricaina contendo o removido agarose e preencher o anel de câmara com solução tricaina fresco. </li><li> Aplique graxa de silicone para o topo do anel de câmara e anexar com 75 mm x 25 mm lâmina de vidro. Tentar evitar bolsas de ar na câmara, à medida que vão interferir com as imagens de campo claro e desidratar a larva ao longo do tempo. </li><li> Se estiver usando uma placa de Petri comouma câmara de imagem, aplique graxa de silicone para a borda superior da câmara de fundo e encher a câmara inferior com solução tricaina. Decantar cuidadosamente a solução tricaina na tampa e gire a tampa sobre a mergulhar a larva na solução tricaina da câmara de fundo em um pequeno ângulo para evitar bolhas de ar. A câmara será selado devido à graxa de silicone. </li></ol> 6. tempo-lapso <ol><li> Montar uma câmara de incubação aquecida como descrito no 23,24 (Figura 4) .Colocar a câmara de incubação em torno do microscópio e ligar o aquecimento. Ajustar a temperatura para 28 ° C durante cerca de 10 - 20 minutos ou até que a temperatura tenha estabilizado. </li><li> Abra a parte frontal da câmara de incubação aquecida e colocar a câmara de imagem no suporte da lamela de microscópio com voltada para cima no sentido do objectivo. </li><li> Posicionar o fin de larvas de uma maneira que 2/3 do campo de visão permanece desocupado. Isto assegura a captura docrescimento e regeneração da barbatana ao longo do procedimento de imagiologia, sem ter de reposicionar a larva. <ol><li> Ajustar a larva montada a 28 ° C durante ~ 30 min antes de se iniciar a gravação de lapso de tempo para evitar mudanças na intensidade de campo claro ou potenciais alterações de agarose. Em alternativa, utilizar tampão pré-aquecido para começar imagem após curto tempo de ajuste. </li></ol></li><li> Para configurar a gravação de lapso de tempo, abra a janela 6D Multidimensional Aquisição no software Axiovision e selecione a opção z-stack e time-lapse. </li><li> Opcional) Na guia z-stack e Modo Slice, selecione a espessura de corte e, em seguida, selecione o modo de Start / Stop. </li><li> Definir a posição superior e inferior da pilha. </li><li> Na guia de lapso de tempo, selecione o intervalo e a duração do filme e, em seguida, iniciar o filme pressionando o botão de partida. Descobrimos que a intervalos de 30 minutos são suficientes e neste intervalo não gera dados excessiva; no entanto Shortepode ser utilizado o intervalo r. </li><li> Verificar as dimensões de posição e z-stack durante a primeira hora, se a larva não foi pré-ajustado. Se necessário, reposicionar a larva de novo depois de um dia, como a larva pode ter deslocado. </li><li> Salve o arquivo no final da gravação de lapso de tempo e continuar com o pós-processamento e quantificações usando software de análise de imagem disponíveis, tais como Imaris 25 ou o open source pacotes de software Imagem J 26 e 27 de Fiji. </li></ol> Análise 7. Dados <ol><li> A determinação do comprimento da aleta. <ol><li> Abra o filme de lapso de tempo no software de imagem e salvar os arquivos no formato de arquivo proprietário para melhorar o desempenho do software. </li><li> Selecione a vista ortogonal para exibir seções individuais como pilhas projetadas. Para a correção de deriva, sob o menu de Fiji, selecione Plugins, em seguida, Registro, e &#39;deriva 3D correcta&#39;. Isto irá abrir uma janela de Fiji e realizar as correções de deriva. Corretodesvio rotacional no Spots função Imaris. Como alternativa, instalar os plugins StackReg e TurboReg em Imagem J e importar para Fiji. Escolha o algoritmo de transformação desejada no plugin StackReg. </li><li> Para medir distâncias (por exemplo, diâmetro da ferida ou comprimento fin), selecione a opção &quot;adicionar novos pontos de medição&quot; na barra de ferramentas superior esquerdo. <ol><li> Em &#39;lista Configurar de Estatísticas visíveis Valores &quot;no menu inferior esquerdo, selecione os valores de estatística a ser exibido. </li><li> No &quot;Modo de linha &#39;, na guia configurações, selecione&#39; Pairs (AB, CD ...) &#39;. </li><li> Em &#39;Labels Propriedades&#39; selecionar &#39;Name&#39; e &#39;Distância&#39;, para exibir a distância entre os pontos A e B ao lado da linha de medição. </li><li> Alternar para o modo &quot;Editar&quot; e mantenha pressionada a tecla Shift para selecionar o primeiro ponto no final da notocorda. Em seguida, use a mesma configuração para selecionar o segundo ponto na margem fin distal. </li><li> Na aba &quot;Estatísticas&quot;, selecione o botão de disco (Export All) no canto inferior direito para exibir e exportar a distância na imagem. </li><li> Repita as medições em momentos selecionados movendo o controle deslizante abaixo da imagem para a direita. Em vez de criar novos pontos de medição, os anteriores podem ser reposicionados selecionando primeiro o ponto com o botão esquerdo do mouse, em seguida, pressionando simultaneamente a mudança e com o botão esquerdo do mouse na nova posição. </li></ol></li><li> Em alternativa à opção de pontos de medição, utilizam o espectador fatia para medir distâncias. No modo de exibição fatia, vá até a posição desejada e clique na primeira e segunda posição com o botão esquerdo do mouse. A distância será exibida. Essa opção, entretanto, não permitem a exportação de dados. </li></ol></li><li> Determinando comprimento da nadadeira e área em ImageJ. <ol><li> Abra o filme de lapso de tempo em ImageJ usando um plugin que reconhece o formato de arquivo .zvi. Em alternativa, carregue em um Quarquivo ickTime ou seqüência tiff. Nota: Se estiver usando um formato de arquivo TIFF, as dimensões da imagem não precisa ser especificado. </li><li> Se abrir um formato de arquivo diferente, sem as informações do arquivo, selecione &#39;Definir Scale&#39; no menu &#39;Analisar&#39; para primeiro definir a distância e unidade de imagem. No &quot;Menu Scale&quot;, digite o &#39;Distância em pixels&#39;, abaixo do tipo na &quot;distância conhecida &#39;para o valor de pixel (isso pode ser obtido através da medição do número de pixels em uma barra de escala que foi acrescentado à imagem e clique em Medir para obter o resultado), e os &#39;Unidade de comprimento &quot;(tipicamente&#39; mm &#39;). Em seguida, clique em OK. </li><li> Para a medição da área fin selecione a ferramenta &#39;Seleção Freehand &quot;na barra de ferramentas e delinear a área fin, segurando o botão esquerdo do mouse pressionado enquanto desenha ao longo do contorno da barbatana. Para medições de comprimento da nadadeira, selecione a ferramenta &#39;Straight&#39; linha e desenhar uma linha entre os pontos desejados para sermedido. </li><li> Clique na opção &quot;Measure&quot; em &quot;Analisar&quot; para exibir a área e comprimento da nadadeira. Repita este passo quantas vezes for necessário para vários pontos no tempo do filme. </li></ol></li><li> Usando estatísticas software os dados podem ser apresentados graficamente. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture.">et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li><li>Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-2+controls+directional+chain+migration+of+cerebellar+granule+neurons.">Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons.</a> PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. 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Os autores não têm nada a revelar.

O método apresentado permite observar a cicatrização e regeneração de tecidos em viver com larvas do peixe in vivo time-lapse de imagens em uma lupa estereoscópica brightfield, usando um relativamente simples set-up. Este procedimento requer alguns aspectos importantes que nós testamos, que irão otimizar o resultado: 1) as concentrações de agarose de baixo (~ 0,5%) irá minimizar os impedimentos de crescimento do contínuo crescimento do peixe-zebra larval, 2) A remoção do agarose em torno do fin é importante não a obscurecer o processo de cura, 3) Trapping a agarose numa malha de plástico mantém a agarose e animal numa posição estável durante o procedimento, e 4) Um ambiente de temperatura controlada adequada, o que é essencial para a viabilidade das larvas. Temos adaptado numa câmara aquecida incubação 23,24, que utiliza bolha que é gravado no cartão, e uma cúpula de aquecedor fios para controlar a temperatura e correcta circulação de ar com flutuações mínimas durante oprocedimento de imagem. Esta câmara simples e eficiente em termos de custo pode estar preparado para se adaptar a qualquer microscópio. A câmara de incubação aquecida semelhante foi também utilizado para ratos de imagem e desenvolvimento pintinho 24,29. Sugerimos que as larvas pré-amputado são montadas uma imagem de pré-amputação por, desmontado para a amputação, e remontado para geração de imagens de lapso de tempo. Embora seja possível para executar essas etapas em um único passo na câmara de imagem final, em nossa experiência, descobrimos que amputar a nadadeira da cauda em uma lamela de vidro não é o ideal, uma vez que rasga o tecido e não resulta em um corte limpo. O método baseia-amputação de agarose utilizando uma agulha de seringa foi originalmente descrito por Kawakami et al (2004) 16 e é também, na nossa experiência, ideal para executar as amputações. Assim, a série um pouco complicado de passos que apresentamos é bem justificada e garante um resultado regeneração ideal. Nós mostramos que LarVal zebrafish em 2 dpf pode ser trabalhada até 1,5 dias em agarose e solução tricaina. Nós solução optimizado-tricaina pH (pH 7), preparado com sal Instant Ocean, que não interfere com a saúde da amostra para o período de imagem apresentada utilizado. Anteriormente, no entanto, também demonstrou que o uso de tricaina em meio Danieau permite time-lapse de imagens de 2,5 dpf zebrafish larval em um microscópio confocal para pelo menos 2 dias 30. Assim, as condições óptimas de tampão pode estender saúde das larvas e a duração das imagens. Em alternativa, as concentrações mais baixas tricaina podem ser utilizados para anestesia, ou 2-fenoxietanol, o que foi bem tolerado durante as fases de larvas e de adultos, a 28 ° C durante pelo menos 60 horas. Para evitar defeitos de regeneração fin, nós removemos o agarose a partir da barbatana caudal antes da imagem. Os nossos dados indicam que no intervalo de 1,5 dias, a aleta tem regenerada até cerca de 60%. Esta taxa de regeneração é consistente com um estudo anterior que define 3 dias poré um tempo médio de regeneração barbatana caudal em larvas do peixe até 6 dpf 16. Métodos alternativos à agarose poderia, contudo, ser utilizados para montar o peixe para a imagem latente. Por exemplo, o plasma fina coagula 31 ou etileno propileno fluorado (FEP) com tubos revestidos de metilcelulose e encheram-se com concentrações muito baixas de agarose (0,1%) foram recomendadas para a microscopia de luz folha 32 e pode ser adequado para o nosso método apresentado. No entanto, não é recomendável metilcelulose e 0,1% de agarose, em que exigem que a amostra são montados na parte inferior da câmara, devido à falta de solidificação destes meios. Concentrações muito elevadas de metilcelulose, além disso, irá gerar bolsões de ar com base em nossa experiência, e estes podem interferir com o processo de criação de imagens. Se estes meios são os preferidos com a utilização da câmara inferior, é importante que uma distância de trabalho adequado entre a lente objetiva ea amostra está presente. Deve notar-se que metilcelulose como um meio de montagem é recomendada apenas para até 1 dia, pois pode interferir com a saúde larval 32. Montando o modelo na tampa pode resultar em um desvio gravitacional para baixo lento. Portanto, é recomendável a imagem várias seções em cada ponto de tempo, que pode ser projetada em um único avião ou apenas imagens que estão no plano focal pode ser extraído para a montagem do filme final. Imaging o espécime na câmara inferior poderia ser uma metodologia alternativa para evitar o potencial de deriva para baixo. Coágulos de plasma pode ser útil para evitar a deriva, como o plasma vai ficar com a camada envolvente exterior (EVL, periderme) 31 e, portanto, pode estabilizar o espécime. Este no entanto tem de ser testada, bem como o tempo de larvas de peixe-zebra pode ser mantida em coágulos de plasma sem interferir com a saúde das larvas ou a regeneração da barbatana. Nosso filme foi montado utilizando seções individuais (26 mm)de uma pilha de z-gravada, que cobria a totalidade da espessura da aleta (~ 10 mm) e que representava potencial z deriva da barbatana durante o procedimento de imagiologia. A fim de reter a informação em 3-D, é também possível projectar-z pilhas em imagens individuais. Porque isto pode resultar em desfocagem da imagem, desconvolução de campo claro podem ser desejada. Software, tais como deconvoluir ou X3 Autoquant poderia ser utilizado para este fim. Alternativamente, os algoritmos matemáticos (descritos em Tadrous 33) pode ser aplicado para a obtenção de um ponto de função propagação de elevada relação de sinal-para-ruído (SNR). A obtenção de um elevado SNR representa um dos principais obstáculos em campo claro de desconvolução. Embora este método requer alto contraste e espessura da amostra fina, que seria adequado para a imagiologia da barbatana da cauda, ​​devido à sua largura reduzida. Uma clara vantagem do método de imagem apresentada é que é rapidamente adaptável a qualquer um estereomicroscópio equipado com uma câmara CCDd software time-lapse e oferece uma alternativa de baixo custo para sistemas de imagem confocal mais caros. Embora este método não utiliza fluorescência para a detecção de células, ele pode ser estendido para tais aplicações, utilizando um sistema automatizado de controle do obturador e pós-imaging software deconvolution 34. Isso permitiria que os usuários observem ainda mais os processos de reparação de feridas e regeneração com única célula ou resolução subcelular durante períodos de tempo mais longos. A claridade óptica e facilidade com que embrionário e zebrafish larval pode ser tratada, e da capacidade de adaptação do método para qualquer microscópio estereoscópico o torna adequado para o ensino de biologia básica vertebrado em uma sala de aula. Este método pode proporcionar aos alunos uma melhor compreensão dos processos biológicos básicos subjacentes reparo e regeneração tecidual. Outros processos biológicos que foram capturados com um método semelhante são o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra 23,34 e cardíacafunction (não publicado). Este método também oferece a possibilidade de reparação de feridas e a regeneração de monitorização em larvas que foram geneticamente manipulados e farmacologicamente.

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48&#34; (Home Depot)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING&#174; HIGH VACUUM GREASE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips 20 &#181;l (Eppendorf, Cat. No. 930001007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe&#160;(BD, Cat. No. 309657)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Discovery.V12 compound microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Plan Apo S 3.5X objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

A técnica apresentada é adequada para elucidar dinâmica de reparação de tecidos, em resposta à amputação. O filme demonstra que a amputação da barbatana inicialmente desencadeia um efeito em bolsa, caracterizado por contracções por meio de cabos de actina-miosina que estão presentes na aleta 28 vezes (Figura 5 A, B). Concomitantemente, as células são extrudados da ferida (ver filme). A contracção pode assim constituir um meio para expulsar as células que são susceptíveis destinados a sofrer morte celular. Os nossos resultados mostram ainda que o crescimento de desenvolvimento da larva ocorre independentemente de regeneração (filme), enquanto a regeneração de aleta não iniciar até cerca de 14 horas após a amputação, conforme medido pelo comprimento da aleta e a área ao longo do tempo de 36 horas após a amputação (Figura 5C , D). O crescimento total de barbatana regenerativo após 1,5 dias foi de cerca de 60% ​​do comprimento da aleta original (Figura 5E). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que tr amputação<html> Iggers contracção barbatana, extrusão de células a partir da ferida, e uma resposta regenerativa temporalmente retardada. Enquanto as células são extrudidos provável destinado a passar por morte celular, a natureza destas células tem de ser clarificado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" /> Figura 1. Imagem conjunto do anel de câmara (A) é mostrado um anel de plástico que está ligado a uma lamela com massa de silicone. Uma malha de plástico é fixada no interior da câmara com quatro pequenos pontos de gordura de silicone. (B) A câmara contendo a larva montado é cheio com solução tricaina uma lâmina de vidro e está conectado à parte superior. (C) A 2 dias de idade larva (seta) é mostrado em maior ampliação para descrever o seu tamanho em relação à malha montado.&quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem câmara montagem feita a partir de placas de Petri. (A) É mostrado um copo comercial tampo de vidro placa de Petri de fundo com uma malha de plástico ligado à lamela de vidro. (B) é mostrado um prato de Petri câmara auto-construída com um buraco perfurado na tampa e uma lamela ligado do lado de fora com massa de silicone. A malha de larva e estão montados no interior da câmara que contém a solução tricaina. Para selar a câmara, graxa de silicone é aplicado na borda superior externa da câmara de fundo e tampa superior em anexo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52654 / 52654fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Esquema de amputação e montagem de uma larva para a imagem latente. (A) para a amputação, coloque uma larva anestesiados em uma placa de Petri revestidas de agarose e amputar a nadadeira caudal com uma agulha de seringa. (B) Para a montagem, transferir a larva com uma pipeta para um tubo de 1,5 ml cheio com 42 ° C de agarose e pipetar um líquido contendo a larva gota na câmara de imagiologia, orientar o peixe e cobrir o solidificado de agarose com forma embrião. (C) Raspar a agarose a partir da barbatana caudal usando uma ponta tapada pipeta microloader ou ferramenta semelhante e substituir médio embrião por meio fresco. (D) Imagem da barbatana caudal sob microscópio estereoscópico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 4. construído Self-câmara de incubação aquecida. (AC) É mostrada uma câmara de incubação aquecida feita de papelão, plástico bolha e Velcro. Um aquecedor de cúpula com fio (originalmente projetado para incubação de ovos de galinha) está ligado à câmara usando fita de alumínio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" /> Figura 5. dinâmica da regeneração Fin. (A) Esquema do método de ensaio de amputação e quantificação barbatana caudal utilizado para determinar o comprimento da nadadeira (seta vermelha) e área (contorno vermelho da fin). (B) Cauda amputação fin inicialmente desencadeia a contração da barbatana, seguindo-se regeexcrescência tecido nerative. A barbatana também passa por crescimento, de desenvolvimento, como evidenciado pelo aumento de tamanho lateral. (C) É mostrado o comprimento da aleta como uma função do tempo, revelando uma partida crescimento regenerativo linear em ~ 14 hPa. (D) Quantificação da área revela uma barbatana inicialmente diminuir em tamanho, o que pode ser atribuído à contracção da barbatana. Depois de ~ 14 horas, o tamanho aumenta fin a uma taxa linear. (E) Comparação do comprimento da nadadeira antes da amputação e depois de 36 horas mostra ~ 60% rebrota. Barra de escala: 100 um Abreviaturas: pré-amplificador, pré-amputação; horas após a amputação, hpa; regen, regeneração; amp, amputação <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/movie1.mp4">Filme</a> . A regeneração da barbatana sobre o curso de tempo de 36hr. É mostrada uma aleta da cauda de um velho larva 2,5 dias durante o curso de regeneração. A partir de 30 min pós amputação crescimento regenerativo é fotografada em intervalos de 30 min em um microscópio estereoscópico usando uma lente objetiva de 3,5x.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K visualizações.  MDI Biological Laboratory. We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Vídeo: Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...