Dentro dos embriões, as células interagem entre si, trocando informações químicas e mecânicas. Uma maneira eficiente de sondar essas interações é matar algumas células e monitorar as consequências nas células vizinhas. O método que descrevemos nos permite abltoar com precisão as células, mesmo dentro do embrião, sem danificar os tecidos vizinhos.
Prepare o microscópio de dois fótons definindo o primeiro laser para o comprimento de onda de ablação 820 nanômetros, e o segundo laser para o comprimento de onda mCherry 1.160 nanômetros. Usando espelhos móveis no caminho óptico, alinhe os dois raios laser na entrada e saída das cabeças de varredura e, em seguida, meça a potência máxima do primeiro laser em 820 nanômetros. Coloque o medidor de potência sob o objetivo, feche a câmara preta e defina a primeira potência laser para 100% Inicie a coleta de dados no medidor de energia, abra o obturador a laser e, em seguida, meça a potência de saída e calcule a porcentagem de potência laser necessária para atingir 300 miliwatts.
Ajuste o primeiro laser para o comprimento de onda de excitação GFP de 920 nanômetros e potência para 7%Ajuste a segunda potência laser para 15% Ative os detectores PMT para linhas verdes e vermelhas e ajuste a sensibilidade pmt verde e vermelha para 65. Ajuste o campo de visão para 400 por 400 micrômetros, resolução de imagem para 512 por 512 pixels e frequência de digitalização para 800 hertz. Selecione o modo de imagem de lapso de tempo 3D e, em seguida, crie uma pasta e ative o Autosave para salvar dados após cada aquisição.
Monte a câmara de aquecimento e coloque-a a 28 graus Celsius. Espere pelo menos 10 minutos para a câmara e objetivo de aquecer. Sob um estereóscópio de fluorescência, identifique embriões a 70% epiboly que expressam GFP.
O, usando uma pipeta pasteur de plástico, transfira três a quatro embriões selecionados no prato revestido de agarose e cuidadosamente descorra-os com fórceps finos. Em um pequeno frasco de vidro, adicione um mililitro de uma solução de penicilina-estreptomicina embrião médio contendo 2%de agarose, e coloque o frasco em um aquecedor de bloco seco pré-aquecido a 42 graus Celsius. Usando uma pipeta de vidro polida em fogo, transfira um embrião descorioado para o frasco, tomando cuidado para não adicionar muito meio de embrião à agarose.
Descarte o meio de embrião restante da pipeta. Aspire o embrião de volta, juntamente com agarose suficiente para cobrir o slide do prato de fundo de vidro. Exploda a agarose com o embrião no escorregador de vidro do prato, garantindo que o embrião não esteja tocando o ar ou o lado plástico do prato.
Em seguida, encha a câmara ao redor do deslizamento de vidro com agarose. Usando um cílio, oriente o embrião para que a região alvo esteja no topo. Após cinco minutos, quando a agarose estiver completamente definida, adicione algumas gotas de penicilina-estreptomicina média ao slide de vidro.
Coloque o prato de fundo de vidro sob o objetivo na câmara aquecida. Mergulhe o objetivo no meio de embrião penicilina-estreptomicina antes de fechar a câmara. Mova o controle deslizante para definir o caminho da luz para oculares.
Ligue a lâmpada de fluorescência. Encontre um embrião e coloque o foco em sua superfície. Desligue a lâmpada de fluorescência e afina o caminho de luz para pmts antes de fechar a câmara preta.
Inicie imagens ao vivo e localize o mesoderme axial. Para ter um bom sinal, ajuste os poderes de laser. Use o canal vermelho para mover o palco para o topo do embrião, e atribua esta posição como Z é igual a zero.
Escolha um passo de tempo de um minuto e um passo Z de dois micrômetros. Coloque a primeira fatia a 15 micrômetros acima do mesoderme axial, e a última fatia a 15 micrômetros abaixo do mesoderme axial. Grave de 10 a 15 minutos de um filme de pré-ablação.
Em imagens ao vivo, localize o contorno polster, em seguida, usando a região moduladora eletro-óptica de interesse, ou ferramenta EOM-ROI, desenhe um retângulo de 20 pixels de tamanho que abrange a largura do polster, e coloque o retângulo no meio do polster. Observe a posição axial dos planos mais altos e mais baixos a serem ablados, garantindo que o ROI não se sobreponha à célula de gema em nenhum dos planos. Coloque o palco na posição Z mais baixa a ser ablado.
Defina o primeiro comprimento de onda laser para 820 nanômetros e digite a porcentagem de potência calculada anteriormente para obter uma potência de saída de 300 miliwatts. Defina a frequência de imagem para 200 hertz e primeiro EOM de imagem a laser a zero. Depois de selecionar o modo tratamento do ROI, desligue o EOM e ajuste o tratamento para iniciar imediatamente após o quadro zero.
Coloque o modo de imagem no Timelapse e desative o Autosave. Depois de selecionar o modo rápido na etapa Tempo, ajuste o número de quadros de tratamento e o número de quadros para o valor correspondente à profundidade alvo. Comece a imagem.
A aquisição deve ser preta, pois o obturador de PMT fecha durante o tratamento de EOM. Em seguida, suba o palco para a próxima posição Z, e da mesma forma realize ablação. Repita em cada posição Z até que o topo do polster seja alcançado.
Quando o processo de ablação estiver concluído, defina o primeiro laser para 920 nanômetros e ajuste à potência de imagem previamente escolhida. Coloque o primeiro EOM de imagem a laser em 100 e opte pelo modo de campo completo. A frequência de imagem deve ser de 800 hertz, e o EOM deve ser desligado antes de examinar toda a pilha em modo ao vivo para verificar se cada avião foi incendiado.
Uma vez confirmada a ablação, selecione o lapso de tempo 3D como o modo de imagem. Reative Autosave, e comece a gravar o filme pós-ablação por 40 a 60 minutos. No filme pós-ablação, verifique se as células-alvo foram efetivamente abladas.
Como as ablações em todos os polsters não devem prejudicar os embriões, a morfologia normal dos embriões ablados pode ser observada a 24 horas após a fertilização. No resultado bem sucedido das ablações a laser, os tecidos sobrepostos não foram afetados pela ablação das estruturas subjacentes. Um tratamento muito intenso, ou muito pouco tratamento, resultou em falhas na ablação a laser.
Um exemplo de ablação mal sucedida mostra células acima do polster sendo abladas, o que ficou evidente por detritos autofluorescentes no plano focal acima do polster. Em outra tentativa ineficaz, as células foram branqueadas, mas não abladas, e sinais de baixa fluorescência ainda revelam os contornos celulares intactos. Finalmente, algumas células nem sequer foram branqueadas devido ao tratamento a laser insuficiente.
A formação de bolhas é devido à cavitação induzida por um tratamento a laser muito intenso. Z-stacks foram capturados a cada minuto durante 40 minutos em uma ablação bem sucedida, registrando tanto o GFP citoplasmado quanto os sinais nucleares mCherry. Além disso, núcleos pertencentes à metade anterior do polster são marcados com um ponto magenta e rastreados ao longo do tempo, antes e depois da ablação.
Como medida de persistência migratória, foi estudada a auto-correlação de células antes e depois da ablação. Células pertencentes à parte anterior do polster apresentaram um movimento persistente antes da ablação, que diminui drasticamente após a ablação, indicando uma perda de migração orientada coletiva. Alinhar adequadamente os lasers e medir a potência do laser são fundamentais para obter resultados reprodutíveis.
Também é fundamental verificar a eficiência da ablação nas primeiras imagens pós-ablação. Usamos ablações a laser para questionar o papel das interações célula-células na orientação da migração de células dentro do embrião. Mas o procedimento poderia ser facilmente adaptado a muitas outras questões onde células ou tecidos precisam ser precisamente ablados, potencialmente profundos no organismo.
