Agradecimentos são devidos a Genia Brodsky para a figura de gráficos; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, e Leonid Roitman para aconselhamento e assistência técnica com o uncaging dois fótons; Maayan tahor e Suliman Elsadin de assistência técnica; Uwe Strahle por ter gentilmente cedido a linha de repórter e neurogenin1 Amos Gutnick para comentários a este manuscrito. A pesquisa no laboratório Levkowitz é apoiado pela Fundação Alemã-Israelense (concessão número 183/2007); Israel Science Foundation (Grant número 928/08) e da Harriet &amp; Marcel Dekker Foundation. GL é um titular da Cátedra de Desenvolvimento de Carreira Tauro em Investigação Biomédica.

Nós descrevemos um protocolo de rotulagem célula usando a fluoresceína enjaulado, no entanto, outros foto-ativável corantes e as proteínas podem ser igualmente utilizados. 1. A injeção de fluoresceína Caged <ol><li> Preparar a solução estoque de 5% (5mg enjaulado-fluoresceína / 100 mL de KCl 0,2 M) de Dextran-conjugado 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzyl (DMNB) enjaulado fluoresceína (10.000 MW dextran, aniônicos, Invitrogen, sondas moleculares, Carlsbad, CA , cat. não. D-3310). Alíquotas e armazenar em -20 ° C. Note-se que DMNB gaiolas fluoresceína é sensível à luz e deve ser mantido no escuro. </li><li> Prepare uma calha de injeção feita de agarose 1% (Sigma, St. Louis, MO, cat. Não. A9539), conforme descrito no &quot;livro O peixe-zebra&quot; 1. </li><li> Prepare 2 litros de E3 por meio de diluição de 100 x solução estoque E3. </li><li> Na noite antes da injeção, prepare gaiolas de acasalamento separar o sexo masculino (s) da fêmea (s) da linha desejada transgênicos expressando um marco visível fluorescente (GFP, RFP, etc) usado para localizar as células-alvo para a fotoativação. </li><li> Prepare agulhas de injeção capilar (Parede Fina capilares de vidro com filamento, instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL, cat. Não. TW100F-6), utilizando um extrator de micropipeta (Sutter Instrumento, Novato, CA, P-97). </li><li> Descongelar uma alíquota de 5% enjaulado fluoresceína no gelo. </li><li> Diluir a solução estoque de 5% enjaulado fluoresceína em KCl 0,2 M para uma concentração final de 1%, e manter em gelo. Evitar exposição à luz. </li><li> Acasalamento configuração cruza preparada na etapa 4. </li><li> Recolher os ovos fertilizados logo que são colocados. Embriões Orient uma célula-fase do molde de injeção agarose revestidas com uma E3. </li><li> Usando uma ponta microloader (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha, cat. Não. 5,242 956,003) backfill uma agulha de injecção com ~ mL 1 de 1% enjaulado solução de fluoresceína. </li><li> Lugar carregado de agulha em um micromanipulador anexado a um gas-powered microinjetor (pneumático picopump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820). </li><li> Ajustar o volume de injeção para 2-3nl e injetar o enjaulado-fluoresceína diretamente no citoplasma da célula. Injetar um mínimo de 50 embriões por experiência. </li><li> Incubar os embriões no escuro a 28,5 ° C na E3 para o estágio de desenvolvimento desejado. Se embriões com mais de 24 horas após a fecundação são analisados, adicione phenylthiourea 0,1% (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. Não. 22290-9) para inibir pigmentação. </li></ol> 2. Embrião de montagem <ol><li> Preparar a solução E2 fresco (ver parte de soluções; pode ser armazenado a 4 ° C por uma semana). </li><li> Casaco de 60 milímetros placas de Petri com uma fina camada de agarose 1% dissolvida em meio E2. </li><li> Prepare 2% baixo ponto de fusão incorporação de agarose (Ultra Pure LMP agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, gato não 16520100..) Para: dissolver a agarose em água destilada estéril por duas vezes aquecimento por microondas até ferver. Mantenha a tampa do tubo está aberta durante o aquecimento. ML alíquota 1 em tubos de microcentrífuga e manter-se em um bloco de aquecimento a 72 ° C. </li><li> Remover o córions dos embriões, puxando cuidadosamente o córion além com uma pinça afiada (n. 5). Manter os embriões em solução E2 em um prato de agar-revestido (ver passo 2). Dechorionated embriões devem ser manuseados com fogo-de vidro polido pipeta Pasteur, pois podem ficar com pipetas de polipropileno. Evite expor o embrião dechorionized ao ar uma vez que estes embriões possam ser danificados pela tensão superficial do líquido. </li><li> Recolher o embrião selecionado em um pequeno volume de E2 usando um fogo-de vidro polido pipeta Pasteur, e colocar o embrião em 60 milímetros prato de Petri. Montar uma gota (~ mL 150) de agarose 2% (passo 3) ao lado do embrião. Rapidamente misturar as duas gotas para obter um homogênea finais ~ 1% mistura de agarose e usando um microscópio de dissecação orientar o embrião com o lado dorsal de frente para a lente objetiva. </li><li> Aguarde até que a agarose solidificou e adicione meio E2 até o embrião incorporado é submerso em líquido. É preferível obter um único embrião por prato, pois pode ser liberado do agarose após o processo de fotoativação. </li></ol> 3. Fotoativação <ol><li> Nós usamos uma Zeiss LSM 510 META NLO dois fótons microscópio equipado com uma banda larga ajustável (700-1020nm) Mai Tai-laser de femtosegundos HP-de Spectraphysics. </li><li> Coloque o embrião montado em um suporte da placa sob o microscópio. O marco fluorescente no embrião é visualizado utilizando 40x/0.8W água Achroplan imerso objetivo. Para as etapas seguintes que usamos não descanned detector (NDD) com a banda passar filtro (BP) de 500-550nm. </li><li> Como pré-requisito para o processo de fotoativação, obter informações fluorescentes espacial da região de interesse através da aquisição de série de imagens da mais ventral com a parte dorsal do sinal detectado fluorescente com dois fótons de comprimento de onda do laser de 860nm (para a detecção de GFP). Para este fim, resolução suficiente pode ser obtida usando uma extensão de 6μm entre cada plano adquirido focal. </li><li> Selecione o destinoz-plano de fotoativação e trazer esta região em foco. Dependendo da finalidade do experimento, a região de interesse pode ser dentro ou fora do marco GFP visível. Dê uma única imagem neste z-plano. Salvar a imagem e mantê-la aberta em uma janela separada. </li><li> Definir o comprimento de onda do laser de dois fótons de 720nm e quando o laser está em modo bloqueado abrir o menu &quot;Editar lixívia&quot;. Definir a região de interesse (ROI) para fotoativação de acordo com a imagem tirada em 860nm (Etapa 4) usando o menu &quot;Definir Região&quot;. É crucial para selecionar o ROI sobre esta imagem após mudar o comprimento de onda do laser para 720nm como a ação muda o último x, y posições do campo observado. </li><li> Ajuste os seguintes parâmetros para fotoativação no menu &quot;Editar lixívia&quot; (ver passo 9): a) potência do laser relativa; b) número de iterações; c) velocidade de verificação. </li><li> &#39;Bleach&#39; imprensa na janela &quot;Editar lixívia&quot; e aguarde até o pára laser. </li><li> Voltar para 860nm, adquirir uma imagem de plano único para avaliar a intensidade do material resultante fotoativado e uma segunda série de aquisição de imagem para avaliar o Z-span (espessura) do domínio ativado. </li><li> Considere os seguintes parâmetros para fotoativação: <ol class="lalpha"><li> Deve-se empiricamente determinar as condições ideais para fotoativação variando dois parâmetros: laser intensidade e duração da fotoativação. A potência do laser em relação pode ser controlado pelo acusto-Optic Modulador de transmissão (OMA). A duração da fotoativação é uma função do número de iterações ea velocidade de varredura. </li><li> Determinar a faixa linear da intensidade de fluorescência, a fim de evitar a saturação da fluorescência uncaged. </li><li> Existe uma correlação linear entre a intensidade de fluorescência obtida das moléculas uncaged ea extensão do eixo z do clone fotoativados 2. </li></ol></li></ol> 4. Detecção da fluoresceína Uncaged <ol><li> Após fotoativação, aumentar os embriões no escuro a 28,5 ° C em meio contendo 0,1% E2 PTU para prevenir o aparecimento de pigmentação da pele. </li><li> Na fase de desenvolvimento desejado, remover o embrião do agarose sob um microscópio de dissecação. Usando um bisturi pontiagudo, criar um &quot;V&quot; incisão em forma na agarose perto do embrião para que o &quot;V&quot; está apontando em direção à cabeça do embrião. Coloque uma pinça fechada no momento do &quot;V&quot; perto da cabeça do embrião e empurre abrir a fórceps separando os agarose ao longo do comprimento do embrião e liberando o embrião para o meio. </li><li> Coletar os embriões com um fogo-polido pipeta Pasteur e corrigir com paraformaldeído (PFA; 4% em 1 x PBS, pH 7,2) tanto para três horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover a solução fixadora e enxaguar 2-3 vezes em PBST por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar embriões com metanol 100% por 10 min, reabastecer com metanol fresco e incubar a -20 ° C por pelo menos 2 horas. </li><li> Reidratar embriões por incubações sucessivas (5 min cada) em uma série de metanol diluído em PBSTr: 80%, 60%, 40% e 20%. Lave 2 x 10 minutos em PBSTr. </li><li> Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente em 500 mL de solução de bloqueio. </li><li> Adicionar um anti-fosfatase alcalina de fluoresceína-(AP) fragmentos Fab (Roche, Palo Alto, CA, cat. Não. 11426338910), diluído 1:500 em solução de bloqueio e incubar overnight a 4 ° C (tubos de microcentrífuga lugar em seus lados) . </li><li> Lavar 5 x 15 minutos em PBST. </li><li> Lavar por 5 minutos em NaCl 0,2 M em TNT. </li><li> Lavar por 5 minutos em 0,4 M NaCl em TNT. </li><li> Equilibrar 3 x 5 minutos em solução preparada na hora Prestain. </li><li> Dissolver um comprimido Fast Red (Roche, Palo Alto, CA, cat. Não. 11496549001) em 2 mL de solução Prestain. Recomenda-se filtrar a solução usando papel Whatman No. 2 para omitir-un dissolvido partículas. Alternativamente, spin down solução e usar o líquido claro sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 mL de solução rápida Vermelho para cada tubo, incubar no escuro à temperatura ambiente, eo desenvolvimento da cor do monitor até que o desejado relação sinal-fundo é atingido (20 minutos a várias horas). Se desenvolve de fundo, a transferência para 4 ° C. Após uma hora de incubação, repor com uma solução de coloração nova Fast Red. </li><li> Parar a reação de coloração por 3 x 5 minutos lavagens em PBST. </li><li> Correção para 20 minutos em PFA 4% à temperatura ambiente. </li><li> Lave 2 x 5 minutos em PBST. </li><li> Embriões clara através de uma série de 25%, 50% e glicerol 75% em PBS até que os embriões são liquidadas na parte inferior do tubo. Embriões podem ser armazenados a 4 ° C por alguns dias. </li></ol> 5. Visualization fluorescentes da Área Uncaged <ol><li> Prepare uma lâmina de microscópio para a montagem: com uma seringa de 1 mL aplicar quatro manchas de graxa de silicone clara sobre o slide, colocado a uma distância de ~ 15 milímetros uma da outra. Montar o embrião no center em ~ 200 mL de glicerol 75% e colocar uma lamela (n º 0; 18x18mm) em cima e empurre-a contra o silicone até que a solução de glicerol ocupa a superfície entre os slides. </li><li> Coloque o embrião montada no palco e trazê-lo em foco usando uma objetiva de 40x. Adquirir uma confocal Z-série de imagens usando lasers 488nm e 543nm Argon HeNe como a fonte de excitação. </li><li> A extensão do eixo z do domínio photoactivatated podem ser analisados ​​usando reconstrução 3D do embrião uncaged usando um software de análise de imagem. </li></ol> 6. Soluções <table border="1"><tbody><tr><td> 100 x E3 </td><td> 174mM NaCl, KCl 21mm, 12mm MgSO 4, Ca 18mm (NO3), 15mM HEPES, pH = 7,4. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> 20 x E2 </td><td> 0.3M NaCl, 10mM KCl, 20mM CaCl 2 * 2HOH, MgSO 4 * 20mM 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 mm Na 2 HPO 4 * 2HOH, filtrado e armazenar em temperatura ambiente </td></tr><tr><td> 1 x E2 </td><td> Diluir 20 x E2 em água bidestilada e adicionar acabado de fazer NaHCO 3 (para concentração final de 0,7 mm), penicilina e estreptomicina (solução diluída strep caneta para uma concentração final de 1 x que contém 100U de penicilina e estreptomicina 100 mg por ml (Invitrogen , Carlsbad, CA, cat. não. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0,1% Tween-20 em PBS </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> Triton 0,3% em PBS </td></tr><tr><td> Solução de bloqueio </td><td> 10% BSA, Triton 0,3%, DMSO 1% em PBS </td></tr><tr><td> TNT </td><td> PH-7.5 Tris-HCl 100mM, NaCl 150mm, 0,5% de Tween-20 em água destilada duas vezes </td></tr><tr><td> Solução Prestain </td><td> PH-8.2 Tris-HCl 100mM, NaCl 0,4 M, 0,1% Tween-20 em água destilada duas vezes </td></tr></tbody></table> 7. Resultados representante Um exemplo do uso de dois fótons de microscopia para photoactivate agentes em um embrião de peixe-zebra viva é apresentado. Utilizando uma abordagem similar que anteriormente traçou a linhagem do fotoativados rotulados progenitores neurais no cérebro zebrafish 2,3. A Figura 1 mostra fotoativação de uma gaiola corante traçador fluoresceína conjugada na placa neural anterior de embriões zebrafish carregando uma neurog1:: gfp repórter transgene, que serviu como um marco vivo intrínseca. Embriões foram injetados com fluoresceína enjaulado na fase uma célula e embebidos em agarose no estádio de gema. Em 3-5 somitos palco as coordenadas espaciais foram medidos no neurog1:: gfp embrião transgênico para determinar a região de interesse (ROI) para uncaging (Figura 1A, A &#39;). Nós uncaged o marcador de linhagem de fluoresceína em um domínio específico da placa neural (Figura 1B, B &#39;). Posteriormente, o destino deste subdomínio progenitor dada rotulados neural foi determinada em prim5 (24 horas após a fecundação) estágio por imunocoloração da fluoresceína uncaged (Figura 1C, C &#39;). A extensão de dois fótons uncaging laser, ou seja, a intensidade da fluorescência uncaged ea espessura do domínio fotoativados (z-span), pode ser controlada através do ajuste de dois parâmetros: intensidade do laser e duração. Este último pode ser controlada pelo ajuste do número de iteração e velocidade de digitalização (ver parte 3, o passo 9; Russek-Blum, 2009). No exemplo mostrado na Figura 1, usamos potência do laser em relação de transmissão AOM 12%, 20 iterações e velocidade de digitalização de 25,6 ms / pixel. Usando as configurações, rotulado de ROI contendo 9-10 células e uma fotoativados z-span de 30μm (~ 1-2 fileiras de células). <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Um resultado Representante da fotoativação de fluoresceína enjaulado em embrião zebrafish ao vivo usando dois fótons de microscopia. Esquemática ilustração (AC) e imagens representativas (A&#39;-C &quot;) do processo de fotoativação. Ao vivo embrião zebrafish (A, A &#39;) expressando GFP sob o controle de neurogenin-1 promotor (neurog1:: gfp) que foi injetado com fluoresceína enjaulado traçador corante na fase célula 1. No 3-5 - estágio somito, uma área distinta do primórdio do prosencéfalo (diencéfalo) foi fotoativado e as uncaged fluoresceína traçador corante poderia ser detectado (B, B &#39;). Após a fotoativação procedimento, o embrião foi incubado a 28,5 ° C e as células do cérebro que contém a fluoresceína uncaged foram traçados por anti-fluoresceína imunocoloração menos 24 horas após a fertilização (hpf; C, C &#39;). Dien, Diencéfalo;. Tel, Telencéfalo..

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+(Brachydanio+rerio.">The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio.</a> , (1995).</li><li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon.">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li><li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning.">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li><li>Kozlowski, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+caged+neurotransmitters.">Using caged neurotransmitters.</a> Nature. 337, 583-584 (1989).</li><li>Zucker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorelease+techniques+for+raising+or+lowering+intracellular+Ca2.">Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2.</a> Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).</li><li>Neveu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+retinoic+acid+for+one-+and+two-photon+excitation+in+zebrafish+embryos.">A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).</li><li>Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. 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Foto-ativável compostos são moléculas cuja função é mascarado, até que são iluminados com um comprimento de onda específico (geralmente UV), induzindo uma reação fotoquímica que converte as moléculas em um estado biologicamente ou quimicamente ativas. Essas sondas fornecem ferramentas muito poderosas na investigação em biologia celular, uma vez que a ativação pode ser controlado com precisão temporal e espacialmente, limitando a sua exposição à luz. A vantagem significat...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3310</td>
<td>molecular probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose for injection trough and coated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic picopump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>22290-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose for embryo mounting</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra Pure LMP agarose</td>
<td>16520100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11496549001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

Fotoativação de compostos alvo em um organismo vivo tem se mostrado uma abordagem valiosa para investigar vários processos biológicos, tais como o desenvolvimento embrionário, sinalização celular e fisiologia adulta. A este respeito, o uso de microscopia multi-fotão permite fotoativação quantitativa de um determinado agente luz responsivo em tecidos profundos em uma resolução única célula. Como embriões zebrafish são opticamente transparentes, o seu desenvolvimento podem ser monitorados in vivo. Essas características tornam o zebrafish um organismo modelo perfeito para controlar a atividade de uma variedade de agentes químicos e proteínas pela luz concentrada. Aqui nós descrevemos o uso de microscopia de dois fótons de induzir a ativação de fluoresceína quimicamente enjaulado, que por sua vez, permite-nos a seguir o destino de células em embriões vivos zebrafish. Nós usamos embriões expressando um marco vivo genética (GFP) para localizar e precisamente alvo as células de interesse. Este procedimento pode ser igualmente utilizado para a ativação induzida luz precisa de proteínas, hormônios, pequenas moléculas e outros compostos enjaulado.

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Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microscopia multifotônica permite o controle de fótons de baixa energia com penetração profunda e fototoxicidade óptica reduzida. Descrevemos a utilização desta tecnologia para a rotulagem de células vivas em embriões de peixe-zebra. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para foto-indução de várias moléculas sensíveis à luz.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K visualizações.  Weizmann Institute of Science. Microscopia multifotônica permite o controle de fótons de baixa energia com penetração profunda e fototoxicidade óptica reduzida. Descrevemos a utilização desta tecnologia para a rotulagem de células vivas em embriões de peixe-zebra. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para foto-indução de várias moléculas sensíveis à luz.

Vídeo: Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...