Para começar, pique os cérebros isolados em pedaços no tubo cônico de 50 mililitros com uma lâmina de bisturi descartável estéril. Adicione tripsina ao tubo a uma concentração final de 0,25% Mergulhe o tubo em um banho de água quente de 35 a 38 graus Celsius por 15 minutos. Pipete suavemente a suspensão de tecido para cima e para baixo para dissociar as células.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros de soro fetal bovino à suspensão homogeneizada para neutralizar a atividade da tripsina. Filtre a suspensão celular através do filtro de células de malha de nylon de 70 micrômetros. Usando um êmbolo de seringa de um mililitro, triture suavemente o tecido no filtro de células.
Em seguida, centrifugue o tubo cônico a 300 g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar a poli-L-ornitina nos balões T25 e enxaguar os balões três vezes com cinco mililitros de PBS. Transvase cuidadosamente o tubo para remover o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular pipetando suavemente com dois a três mililitros de meio neurobasal completo.
Plaquear as células nos frascos T25 revestidos com poli-L-ornitina com aproximadamente 20 milhões de células por frasco em cinco mililitros de meio neurobasal completo. Incube a cultura de células a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono. Os neurônios em frascos T25 e placas de 96 poços aderiram e formaram processos de neuritos no terceiro dia.
As culturas de neurônios abaixo do ideal continham aglomerados de células e detritos.
