Agradecemos Lab membros Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Li Rong, Qin Wan, Congxiao Zhang, Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova para ajudar na caracterização destas culturas de células. Um agradecimento especial a Jing Zhao, Zhi Connie, e Banzon Tina pela sua ajuda na manutenção de grandes estoques de culturas de células. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Research Program intramuros.

1. Tecido fetal humano Todas as pesquisas de tecidos humanos relacionados segue os princípios da Declaração de Helsinki e do NIH conselho de revisão institucional. Olhos do feto são obtidos por um procurador independente, Advanced Resources Bioscience (ABR, Alameda, CA), a partir de doadores aleatórios de 16 a 22 semanas de gestação, colocado em RPMI-1640 contendo tubos de media (fornecido pela ABR), embalado em gelo e entregues por um serviço durante a noite prioridade de entrega. Tecidos permanecem viáveis ​​até 48 horas após enucleação. 2. Meio de cultura celular MEM-alfa modificado médio (Sigma-Aldrich) é usado como meio base para preparar 5% e 15% de soro contendo meios para cultura de células RPE (EPR médio; Tabela 1 abaixo). <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Quantidade </td><td> Armazenamento </td></tr><tr><td> MEM, alpha modificação </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 mL </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> N1 suplemento </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 mL </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 mL </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutamax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 mL </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Não aminoácidos essenciais </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 mL </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> * THT </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Taurina </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hidrocortisona </td><td> H-10 0396 </td><td></td><td> 10 mg </td><td></td></tr><tr><td> Triiodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 mg </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovino ** soro </td><td></td><td></td><td> 5% ou 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Humana Componentes RPE Fetal Médio de Preparação de 500 mL Médio THT * é feito através da dissolução taurina hidrocortisona-triiodo-thyronin em 1 1,5 mL PBS antes de fazer o meio. Alíquotas múltiplas são feitas e armazenadas a -80 ° C para simplificar a preparação cultura do meio de cultura. ** Soro fetal bovino não é obtido da Sigma-Aldrich ou Gibco. Soro fetal bovino utilizado na preparação de mídia é obtido a partir de Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Cada frasco do soro é inactivado pelo calor (56 ° C durante 1 hora) antes do uso. Para garantir a consistência quantidades de cultura de células grandes de soro de um mesmo lote são comprados e armazenados em -20 ° C até serem utilizados para a preparação de meios de comunicação. Células pouco semeada a partir de um lote específico de células hfRPE são cultivadas em 24 - ou 12 - placas bem por algumas semanas em meios contendo 20% FBS de lotes diferentes. As células que mais cresce melanated com a morfologia RPE mais clássico (paralelepípedos) indicam um lote apropriado soro que pode ser usado para cultura de células. Meio de cultura celular também contém: N1 suplemento (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL, Glutamax / penicilina-estreptomicina 1:100 mL / mL (Gibco), e solução de aminoácido não essencial (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL. Além disso, hidrocortisona (20 mg / L), taurina (250 mg / L) e triiodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) é preparado antes dissolvendo esses três componentes em PBS para uma concentração final de 1:500 (mL / mL). Alíquotas de THT são armazenadas a 80 ° C até que adicionadas ao meio de RPE. 3. Cultura de células Após a recepção, globos intactos são lavados em solução antimicótica antibiótico (diluído 10X;.. Cat sem 15240-096; Invitrogen) e gentamicina (1 mg / mL) por 3 a 5 minutos (Figura 1 abaixo). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Depois que os antibióticos de incubação são enxaguados duas vezes com meio, como HBSS ou PBS. Um globo ocular no momento em que é transferido para 10 centímetros prato de Petri com revestida com Sylgard-184 (WPI) e fixado com 27G agulhas. Usando uma faca de corte raso porta lateral (Alcon) é feita uma incisão através da esclera abaixo do corpo ciliar (1 / 3 da distância do equador do globo ocular para a superfície anterior). Esta incisão é usado para iniciar um corte circular para a remoção da porção anterior do olho. Este corte é feito usando um revestimento de carboneto de tungstênio-tesoura curva íris com uma lâmina serrilhada (FST). Antes da remoção da parte anterior do olho, um corte é feito através do corpo vítreo, para evitar desmontar o retina do RPE no pólo posterior. Após a parte anterior do olho é removido, o pólo posterior é incubada com dispase-I a solução (2 U / mL, gato não 04942086001;.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) em 5% meio contendo soro de 40-60 minutos em 37 ° C-CO 2 5%. Após o tratamento dispase, os pólos posterior são transferidos para um HBSS em placas de Petri com o silício estofamento (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) e dissecados em quadrantes ou pedaços maiores para aplainar suficientemente tecidos. Em seguida, a retina é gentilmente removido com uma pinça. Camadas de uma única célula RPE foram descascadas e em folhas coletadas diretamente em solução de tripsina-EDTA (Gibco, # 25200-056) frio. Após o RPE são coletados, tubos com tecidos em tripsina-EDTA são selados e transferidos para banho-maria durante 10-15 minutos a 37 ° C. Após 10 minutos de incubação, os tubos são agitados vigorosamente para separar RPE em pequenos grupos. Se a separação não é completa, os tubos são colocados de volta em banho-maria por mais 5 minutos. Depois de tripsina-EDTA de incubação, os tubos são inspecionados quanto a possíveis não-dissolvido grupos de células mistas. Qualquer aglomerados observados são removidos com ponta fina de vidro Pasteur pipeta. Depois de girar para baixo (1,4 rpm em centrífuga clínica para 4 minutos), as células hfRPE são re-suspensas em media RPE 15% e, em seguida, colocada em frascos Primaria (exemplo: gato não 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Este meio é substituído após um dia com o meio RPE 5% de soro contendo, e alterações subseqüentes foram feitas a cada 2 a 3 dias. Após 3 a 4 semanas, as células tornaram-se confluentes e uniformemente pigmentados. Eles são, então, tripsinizados em 0,25% de tripsina-EDTA por 10 a 15 minutos, re-suspenso em 15% de soro contendo RPE meio de cultura celular, e semeados em inserções de cultura de células claras em 150 a 200K células por poço (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), utilizando pastilhas de 12 mm de diâmetro, 0,4 pores-um, as membranas de poliéster (exemplo: gato não 07-200-161, Fisher Scientific)... Antes da semeadura, os poços foram revestidos com matriz extracelular humano (10 mg em 150 mL por poço HBSS, gato não 354237;.. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e curado com luz UV na capa de duas horas. Em alguns casos, o procedimento foi repetido tripsinização pela segunda vez, para coletar as células que se soltou após o tripsinização primeiro. O mesmo protocolo (excluindo revestimento com ECM) foi utilizada para células de cultura nos frascos para gerar a população P1 de células. Essas células foram utilizados em experimentos, quando eles tinham uma resistência do tecido total de ≥ 200 Ω • cm 2 e foram uniformemente pigmentados. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Por favor, clique aqui para aumentar a figura 1</a> . 4. Procedimentos passo a passo <ol><li> Prepare 12 bem-placa com múltiplas soluções (para cada olho 4 poços necessário): <ol class="lalpha"><li> adicione a solução de antibiótico antimicótico 10x - 1 poço / olho </li><li> adicionar PBS / HBSS solução para enxaguar - 2 poços / olho </li><li> adicione a solução de dispase - 1 poço / olho </li></ol></li><li> Prepare dissecar placa de Petri por desembalar 5 agulhas de fixação e preenchê-lo com HBSS </li><li> Olhos descompactar e colocá-los em solução antibiótica-antimicótica por 3-5 minutos (preparado no passo 1) </li><li> Lave os olhos em dois poços (preparado na etapa 1) com PBS / HBSS, em seguida, transferi-los para dissecar prato. </li><li> Muscular excessiva caimento e tecido conjuntivo ao redor dos olhos </li><li> Usando 27G agulhas seguras (pino para baixo ao silício base) olhos em dissecar prato alinhá-las de uma forma onde enfrenta córnea. </li><li> Usando uma faca porta lateral fazer incisão abaixo córnea, onde o corte circular começará </li><li> Usando uma tesoura iris fazer corte ao redor dos olhos, em seguida, usando a tesoura mesmo cortar vítreo e levante porção anterior do olho de distância. Nota: nos passos 3-8 evitar qualquer pressão excessiva mecânica para globo ocular. </li><li> Transferência de olho aberto na solução dispase (preparado no passo 1) </li><li> Incubar copo olho por 40-60 minutos a 37 ° C com 5% de CO 2 </li><li> Substituir solução HBSS em dissecar prato com um doce. </li><li> Transferência de olho de solução para dispase prato de dissecação. </li><li> Olho posição na placa de Petri (copo globo ocular para cima) e seguro com duas agulhas 27G. </li><li> Levantar delicadamente retina parcialmente separados e usando uma tesoura corte da retina retina de distância do nervo óptico. Descartar retina. </li><li> Com uma tesoura de íris fazer uma incisão da periferia do olho em direção ao nervo óptico. </li><li> Usando todos os cinco agulhas 27G achatar olho camada de RPE fazendo muito bem esticado. </li><li> Com uma tesoura corte da retina fazer circular ao redor do nervo óptico que separa camada de RPE do apego ao nervo óptico. Nota: os passos 13-17 pode ser feito com baixa ampliação ou sem microscópio estéreo </li><li> Estereomicroscópio ajustar a ampliação 250xou mais e encontrar borda da folha de RPE perto do nervo óptico ao longo do corte feito pela íris tesoura. </li><li> Utilizando duas pinças de membrana separadas RPE-Bruch da camada de tecido da coróide. Ela pode exigir algumas tentativas para encontrar área ao longo da borda, onde a conexão de RPE e coróide é mais fraco. </li><li> Coloque folhas de RPE em solução de tripsina-EDTA frio em 15 mL do tubo </li><li> Após o RPE são coletados tubos, boné e transferência com tecidos em tripsina-EDTA em banho-maria por 10-15mins a 37 ° C. </li><li> Após 10 minutos de incubação, agitar vigorosamente tubos de 15 mL para separar RPE em pequenos grupos. Se a separação não é completa, coloque os tubos de volta em banho-maria por mais 5 minutos. </li><li> Inspecione os tubos para possíveis não-dissolvido grupos de células mistas. Qualquer aglomerados observados devem ser removidas com ponta fina de vidro Pasteur pipeta. </li><li> Spin para baixo (1,4 rpm em centrífuga clínica para 4 minutos) células hfRPE, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 15% RPE mídia (9 total ml) </li><li> Coloque 3 mL de suspensão de células em frascos Primaria adicionar 2 mL da nova media 15% RPE, frasco lugar em incubadora até o dia seguinte (37 ° C CO, 5% 2) </li></ol> 5. Resultados representante Validação funcional de cultura de células hfRPE Em experimentos anteriores, temos usado essas culturas primárias para determinar a expressão de polarização, e função de proteínas transportadoras de membrana plasmática e identificar rotas de sinalização específicas que regulam a função RPE 11/01 Estas características são acumulados à medida que fornecem uma validação conjunto de propriedades que podem ser aplicadas a cada geração celular. Os experimentos resumidos a seguir identificar as proteínas que determinam o transporte de fluidos transepitelial ea integridade da via paracelular. Estes experimentos in vitro foram validadas em um modelo animal de retina re reatamento-6. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Localização de CFTR em células hfRPE painel superior esquerdo:. CFTR foi detectada em células hfRPE usando membrana enriquecido extratos. M, marcador de peso molecular; raia 1, as principais madura (banda C) e imaturo (bandas A e B) do painel inferior Centro: localização imunofluorescência de CFTR (selo verde) do painel direito superior: vista de seção transversal ampliada através do plano z mostrando.. máxima intensidade de projeção através do eixo z. ZO-1 (marcado em vermelho) serve como um marcador junção apertada delineando os lados apical e basolateral da RPE. DAPI (azul) rótulos dos núcleos localizados próximos à membrana basal. ZO-1 aparece como amarelo / laranja, já que fluorescence suas sobreposições etiqueta vermelha verde do CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. IFNγ induzida por alterações fisiológicas no hfRPE A:. Adição de IFNγ ao banho basal aumentou transporte de fluidos transepitelial (J v) em monocamada de primárias, as células cultivadas hfRPE J v é plotado como uma função do tempo no rastreamento de topo e fluido líquido. absorção (apical ao banho basal) é indicada por valores positivos; potencial transepitelial (TEP) e resistência do tecido total (R T) são plotados como uma função do tempo nos traços de fundo. B: adição de CFTRinh-172 (5 mM) ao banho basal inibiu o IFNγ estimulada J aumentar v. Abaixo está um exemplo de experiências com animais modelo confirmando hfRPE achados in vitro. Neste experimento, criado artificialmente descolamento de retina foi significativamente reduzida após a adição de IFNg à superfície exterior do olho (Figura 4 A, B). Este efeito pode ser parcialmente bloqueada por: (1) adição de bloqueador de cAMP (Figura 4D), (2) completamente bloqueada após a adição de bloqueadores cAMP JAK +. As imagens abaixo são obtidos utilizando scanner outubro <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Experimentos in vivo descolamento de retina. Os procedimentos para estes experimentos in vivo foram previamente descritos em detalhe 6. Nesses experimentos, descolamento de retina foram criados no olho de rato pela injeção de 0,5-3 mL de solução de PBS modificado para o espaço sub-retiniano (SRS), sozinho ou com uma combinação de JAK-STAT e os inibidores da via de PKA. Cada experimento teve um período de controle inicial de 40-70 min após a criação do descolamento de retina. Durante este tempo, a taxa de variação do volume bolha foi medida para garantir a estabilidade bolha. Tomografia de coerência óptica de imagem (Instituto de Física Aplicada, Russian Academy of Science, Nizhniy Novgorod, Rússia) foi usado para medir a evolução no tempo da mudança de volume no SRS. O tempo de re-vol anexoume mudança foi medida por tomografia de coerência óptica (OCT). Imagens outubro de quatro experimentos diferentes (painéis à esquerda; AD) que mostram uma alteração na dimensão descolamento (setas em A, B e D) após a adição de IFNγ na superfície anterior para 40-70 min. Os painéis A e B mostram que IFNγ aumento Jv de sua taxa de controle (≈ 2 l • • cm 2 hr -1) a 14 e 12 mL • cm 2 • h-1, respectivamente. Após adição de JAK-STAT e os inibidores da via de PKA (C e D), o IFNγ - as taxas de absorção induzida foram significativamente reduzida para 0,2 e 7,9 mL • cm 2 • h-1, respectivamente. Setas indicam o limite da bolha para comparação com a área delimitada dentro da linha tracejada, (volume inicial). Lado direito da figura: top painel de resumo das taxas de medida Jv de várias experiências; meio do painel do filme ( <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">clique aqui</a> ); inferior do painel 3D seções do experimento resumidos na B. Falsa em azul indica a extensão espacial de desprendimento em t = 0 e 40 min após a adição de INFγ. Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com a Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia declaração. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados Animal e Uso do National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+paradigm:+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells.">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell &#38; Melanoma Research. , .</li><li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li><li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+184:+Phototransduction:+RPE+transport+Retina+Phototransduction:+RPE+transport.">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , 2540-2540 (2010).</li><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+Building+polarized+tissue.">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium.">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li><li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+localization,+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+(JAM-C)+in+human+retinal+pigment+epithelium.">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN{gamma}+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport.">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-C+and+-D+induced+proliferation/migration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines.">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li><li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y(2)+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat.">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li><li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li><li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium.">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment,+migration,+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium:+relevance+for+proliferative+retinal+disease.">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li><li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling,+ion,+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li><li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R)-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage.">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nos experimentos, descrevemos modificações adicionais de nossas técnicas previamente publicados 3 projetado para agilizar as várias etapas necessárias para a produção consistente hfRPE culturas primárias com um maior número de células disponíveis por olho. Cada mudança no procedimento original foi rigorosamente testado em fisiologia múltiplas e experimentos de biologia molecular para assegurar que as mudanças não introduzir artefatos e sendo continuamente testado por muitos outros laboratórios usando essas células. Finalmente, experimentos adicionais foram realizados para comparar os resultados in vitro a perturbações semelhantes em modelos animais.

Instrumentos necessários para o protocolo de dissecação <ol><li> Microscópio estéreo - todos disponíveis com x250 ampliação de giro necessário para dissecção </li><li> Prato de dissecação - por exemplo, Kimble 100 x 20mm # 23062 (um por dissecção) de qualquer fonte </li><li> Sylgard 184 - Cat WPI. # SYLG184 * * Para preparar dissecar prato seguir Sylgard 184 incluídas instruções de mistura, despeje elastômero líquido misturado em placa de Petri para formar 5-8mm camada. Permitir elastômero de cura para pelo menos 24 horas. Prato com elastômero curado pode ser esterilizada com etanol 70% e reutilizado várias vezes (~ 100 vezes) </li><li> 27 G de agulhas BD PrecissionGlide 1 ¼ comprimento (5 por dissecção) de qualquer fonte </li><li> Solução 1X HBSS contendo Ca e Mg sais - Cat # 14025 GIBCO 500ml (bom para dissecções múltiplas). </li><li> Iris tesoura serrilhada carboneto de lâmina, curvo - FST Cat # 14559-11 (um). </li><li> Tesouras da retina - Katena Cat # K4-5300 (um). </li><li> Fórceps - por exemplo, Dumont Tweezers # 5 com pontas polidas de Cat WPI # 500085 (2 peças). </li><li> Sideport faca - Alcon, clearcut 1mm, Bevel Dual, Cat angular # 8065921540. </li><li> Centrífuga 15ml tubo - (um em cada olho) em qualquer fonte </li><li> Pasteur de vidro pipeta - (uma por dissecção) de qualquer fonte </li><li> Placa de 12 poços (um por dissecção) de qualquer fonte </li><li> Primaria 25 centímetros Frasco de 2 - (2-3 em cada olho) em qualquer fonte </li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

Nós desenvolvemos um processo de cultura de células que podem produzir grandes quantidades de monocamadas confluentes de humanos primários do epitélio pigmentar da retina fetal (hfRPE) culturas com características morfológicas, fisiológicas e genéticas de RPE humano nativo. Essas culturas de células hfRPE apresentam pigmentação pesado, e microscopia eletrônica mostram extensa microvilosidades da membrana apical. Os complexos juncionais foram identificados com a rotulagem de imunofluorescência de várias proteínas de junção tight. Polaridade epitelial e função dessas culturas facilmente reproduzível primárias assemelham previamente estudados modelos de mamíferos de RPE nativa, incluindo humanos. Estes resultados foram estendidos pelo desenvolvimento de intervenções terapêuticas em vários modelos animais da doença de olho humano. Temos focado em estratégias para a remoção de acúmulo de líquido anormal na retina ou no espaço sub-retiniano. O espaço extracelular subretiniana separa os segmentos fotorreceptoras externa ea membrana apical do RPE e é crítico para a manutenção de anexos da retina e toda uma série de RPE / retina interações.

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Nós fornecemos um método reprodutível para monocamadas confluentes de cultura humana fetal células epitélio pigmentar da retina (hfRPE) células que apresentam morfologia, fisiologia, polaridade, e proteína e os padrões de expressão gênica do tecido nativo adulto. Este trabalho foi estendido para um modelo animal de várias doenças oculares.

Modelos experimentais para estudo da fisiologia epitélio pigmentar da retina e Fisiopatologia

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

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JoVE Journal

Neuroscience

19.2K visualizações.  National Institutes of Health. Nós fornecemos um método reprodutível para monocamadas confluentes de cultura humana fetal células epitélio pigmentar da retina (hfRPE) células que apresentam morfologia, fisiologia, polaridade, e proteína e os padrões de expressão gênica do tecido nativo adulto. Este trabalho foi estendido para um modelo animal de várias doenças oculares.

Vídeo: Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Neurociência

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Ensaios olfativas para o Rato modelos de doenças neurodegenerativas

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Modelos experimentais para estudo da fisiologia epitélio pigmentar da retina e Fisiopatologia

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