Os distúrbios relacionados ao PSE continuam sendo uma parte importante das doenças de mistura, mas sem remanescentes efetivos na cultura virtual de células primárias de EPR para servir como um bom modelo para estudos fisiológicos e patológicos de distúrbios relacionados ao PSE. Neste protocolo, fornecemos um protocolo fácil de seguir para a cultura de IPCs primárias, que poderiam restaurar e manter rapidamente as características de RP posteriores, acreditamos que, usando este método, as pessoas poderiam gerar rapidamente células RP a partir de estudos de macistate e os rastreios de drogas protetoras que poderiam facilitar o desenvolvimento de novo tratamento para distúrbios de RPE. Uma demonstração de valor passo a passo tornará este método muito mais fácil de replicar em diferentes laboratórios que desejam estudar células RP.
Para começar a descongelar a enzima de digestão tecidual malaquad e esterilizar 1X PBS. Suplementado com 2% de penicilina e 2% de estreptomicina filtrando a solução através de uma unidade de filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Lave os poços da placa de cultura e as inserções transwell com PBS 1X.
Retire o PBS dos poços e transwells com uma pipeta e adicione um mililitro de PBS 1X fresco à câmara inferior e 600 microlitros de 10 microgramas por mililitro de solução de laminina à câmara superior. Incubar as placas e as inserções transwell nesta Incubadora de Helicicultura durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois disso, remova a solução laminada da câmara superior e lave com um mililitro de PBS 1X frio duas vezes antes de sentar a célula Limpe o exaustor de fluxo laminado com etanol a 75% e luz UV.
Prepare três tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros contendo cerca de 25 mililitros de etanol a 75%, três tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros contendo cerca de 25 mililitros de PBS 1X e três pratos de cultura de células estéreis de 10 centímetros contendo cerca de 15 mililitros de PBS 1X. Mergulhe quatro globos oculares suínos em cerca de 15 mililitros de etanol a 75% em uma placa de Petri de 10 centímetros e use uma tesoura e pinça para cortar todos os tecidos conjuntivos e músculos residuais. Para descontaminar os globos oculares, mergulhe e lave quatro globos oculares em três tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros preenchidos com etanol a 75% sequencialmente.
Em seguida, lave os globos oculares em três tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros preenchidos com 1X PBS sequencialmente. Inverta os tubos a cada minuto para lavar bem os globos oculares. Mova os quatro globos oculares para um prato de cultura de células estéreis de 10 centímetros contendo 1X PBS.
Apare a superfície externa de cada globo ocular novamente, para remover o nervo óptico e pequenos detritos. Use uma tesoura para fazer um pequeno corte na interseção do limbo e da esclera. E, em seguida, remova a córnea, íris, lente, corpo vítreo e retina neural.
Transfira o complexo da esclera coroide RPE para um novo prato de cultura celular de 10 centímetros e faça quatro cortes para achatar o copo do olho na forma de um trevo de quatro folhas. Realize viagens na digestão de solução de EDTA colocando os quatro complexos de esclera coroide RPE em um novo prato de 10 centímetros e despejando 20 mililitros de solução EDTA de tripsina fresca para mesclar os complexos de esclera coroide de RPE. Coloque o prato na incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius por quase 30 minutos.
Após 30 minutos, retire o prato da incubadora e, adicione 20 mililitros de meio de cultura celular pré-quente com 10% FBS ao prato. Para neutralizar as viagens em solução de EDTA, use uma pipeta de transferência de cinco mililitros para dissociar as células RPE pipetando suavemente várias vezes. Colete as suspensões celulares em tubos de centrífuga de 15 mililitros e, em seguida, pipete suavemente outros 10 mililitros de meios de cultura frescos com FBS para lavar os complexos de esclera de coroides RPE no prato.
Recolher as células RPE centrifugando os tubos a 300 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Aspirar o SuperAgente usando uma pipeta e adicionar mais cinco mililitros de meios de cultura com FBS para suspender novamente as células. Centrífuga a 300 G por mais cinco minutos.
Decantar o SuperAgente e ressuspender as células com 12 mililitros de meios de cultura. Próxima semente 100, 000 a 200, 000 células por poço em 12 placas de cultura de poço ou inserções transwell. Mudar o meio de cultura a cada dois dias e reduzir a concentração sérica para 1% quando as células cobrirem totalmente a superfície dos poços por inserção.
Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células sejam colhidas. As imagens representativas das células primárias de PSE suína no segundo dia, no sexto dia e no dia 10 são mostradas aqui. A análise QRTPCR dos níveis de mRNA de genes de assinatura em células primárias de PSE suíno, células primárias de RPE humana, células ARPE 19 e tecido coroide de RPE suíno é detectada por esta imagem gráfica.
Aqui, o GAP DH foi usado como o gene de limpeza para RTPCR. Quatro replicações biológicas foram usadas para células primárias de RPE suína e uma célula RPE 19, onde três replicações biológicas foram usadas para células primárias de RPE humana e tecido coroide de RPE suíno. Os níveis de expressão gênica nas células ARPE 19 foram definidos como controles.
A análise sanguínea ocidental das proteínas RPE 65 em células ARPE 19 e RPE suína e em células primárias de RPE humana e tecidos coroides de RPE suíno são mostradas nesta figura. Vinculin foi usado aqui como um controle de carga. Esta figura mostra uma cultura de duas semanas de células RPE suínas em meio DMEM Basic com 1% de FBS.
As células cultivadas com ou sem Lamin foram coradas com RPE 65, APTAs de sódio e potássio, Z01 e Hex. As medidas de TR em folhas celulares, cultivadas com ou sem laminina são representadas nesta figura. A análise sanguínea ocidental do fator de crescimento endotelial vascular ou VEGF e fator derivado do epitélio pigmentar ou PEDF em células primárias de PSE suíno e ARPE 19 são mostradas nesta figura.
As funções setoriais das células PSE primária suína cultivada e ARPE 19 são apresentadas nestas imagens. A grande parte deste protocolo é dissolver as células RP dos complexos gliais de chide RPE. Recomendamos o uso de viagens frescas e solução a cada vez e o controle adequado do tempo de digestão, para dissolver oito células RP.
