O epitélio pigmentado da retina ou EPR é crítico para a saúde da retina. E estudar o EPR isolado é crucial para a doença retiniana. Este método de isolamento de EPR da cobaia, um modelo popular de miopia, ajuda a resolver o problema desafiador.
A principal vantagem desta técnica é que é relativamente simples e produz amostra de EPR de alta qualidade adequada para os estudos moleculares biológicos, incluindo a análise de EPR. Seguindo perfeitamente a técnica demonstrada e observando como manipular as ferramentas dissecadoras, pode-se dominar esse procedimento rapidamente com alguma prática. Depois de sacrificar humanamente a cobaia e enuclear os olhos do animal, lave imediatamente os olhos transferindo-os para uma placa de Petri de 10 centímetros contendo solução salina tamponada com fosfato estéril ou PBS.
Após a lavagem, transfira os olhos para a solução de PBS fresca. Agora trabalhando sob um microscópio dissecante, use uma agulha de calibre 18 para fazer uma pequena abertura inicial na esclera de um olho, aproximadamente um milímetro atrás do limite limbal entre a córnea e a esclera. Com tesoura, remova o segmento anterior, incluindo córnea, íris, corpo ciliar e cristalino.
Em seguida, trabalhando com um segmento ocular posterior remanescente, use uma pinça para agarrar e puxar suavemente a zônula de Zinn, seguido de desprender a retina do complexo PSE/coroide/esclera e descascar a retina sem fragmentação. Após a remoção completa da retina, mergulhe o copo ocular posterior restante, que inclui o EPR, a coroide e a esclera, em um dos poços de uma placa de 12 poços contendo dois mililitros de reagente de armazenamento de tecido e mantenha-o imerso por cinco minutos. Para enxaguar o reagente de armazenamento, transfira o copo para outro bem preenchido com quatro mililitros de PBS por 10 segundos antes de movê-lo para um terceiro poço preenchido com dois mililitros de PBS.
Antes de prosseguir para a etapa final de isolamento do EPR, prepare uma seringa de um mililitro preenchida com PBS e conecte uma agulha de calibre 30. Empurre suavemente o êmbolo da seringa para criar um fluxo de jato de PBS. Trabalhando sob um microscópio, primeiro, aponte esse fluxo de PBS para o EPR para fazer um pequeno rasgo ou buraco nele.
Em seguida, direcione o fluxo de PBS para a abertura criada para separar o EPR como uma folha da coroide. Após desprender o EPR da coroide, colete as células do EPR em uma seringa de um mililitro sem agulha e transfira a amostra coletada para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo com o EPR coletado a 8.000 x g por um minuto para obter um pellet de EPR.
Para amostras a serem usadas em análises de RNA, descarte o sobrenadante, que é a solução PBS, e substitua-o por 350 mililitros de tampão de lise, conforme incluído nos kits de isolamento de RNA. Pipete o conteúdo para cima e para baixo 20 vezes para misturar bem e preservar a qualidade da amostra. Para armazenamento e preservação a longo prazo, transfira as amostras para um congelador de 80 graus Celsius negativos.
Use um kit de isolamento de RNA e siga as instruções do fabricante para isolar e coletar o RNA das amostras de EPR antes de avaliar a qualidade da amostra por eletroforese. Em nosso estudo, as amostras de EPR coletadas apresentaram RNA bem preservado com um número de integridade de RNA ou NIR maior que oito. A contagem total de RNA é de cerca de 240 nanogramas por olho.
O nível de expressão do gene específico do EPR, Rpe65, foi significativamente maior nas amostras de EPR do que na coroide e esclera. Em contraste, as amostras de EPR apresentaram expressão mínima do gene específico da esclera coroide selecionada, colágeno tipo alfa-ona, indicando a ausência de contaminantes coroidais e esclerais nas amostras isoladas de EPR. O passo mais importante do procedimento é a remoção suave da retina sem deixar nenhum fragmento de retina.
Este procedimento de isolamento de EPR justifica estudos in vitro em cultura de células com algumas diferenças importantes, incluindo a escolha do meio de imersão das células de EPR após o isolamento.
