Parte 1. Prepare a área cirúrgica <ol><li> Se trabalhar com reagentes de risco biológico (por exemplo, vetores retrovirais), a cirurgia deve ser realizada dentro de um armário de Biossegurança II (BSC). O microscópio backscatter ultra-som (UBM) deve sentar-se junto ao BSC, com o transdutor dentro do BSC, e mantida no lugar por um suporte de motor controlado em um palco especialmente projetado cirúrgico. Os componentes necessários para construir o estágio mostrado no vídeo estão listados na linha. Esta lista, juntamente com imagens do palco de vários ângulos (disponível a pedido), deve permitir a construção. </li><li> A abertura e fechamento da laparotomia (procedimento cirúrgico no qual a cavidade abdominal é cortado para permitir o acesso aos órgãos internos) é geralmente realizada em um pano absorvente com suporte plástico. Antes da cirurgia todas as ferramentas necessárias (por exemplo, de barbear, tesouras cirúrgicas, fórceps, carregado autoclip aplicador, etc) e materiais (por exemplo, PBS, suturas, anestésicos, o titular do mouse e placa sobrejacente, etc) devem ser esterilizados e colocados no área cirúrgica. Limitando a quantidade de tempo que a incisão é aberto é importante para maximizar as chances de sucesso com a cirurgia. Toda a manipulação de animais deve ser realizada com luvas que foram desinfectados com solução de MB-10, ou o equivalente. Desinfecção repetida deve ser realizado conforme necessário para garantir que as luvas são estéreis. </li></ol> Parte 2. Anestesia do mouse <ol><li> Encher uma seringa cc 1 com a solução anestésica contendo 1 parte Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) a 4 partes filtrado esterilizado 25 mg / ml de sulfato de magnésio em PBS. Isso resultará em uma solução que é de 10 mg / ml pentobarbital e 20 mg / ml de sulfato de magnésio. Cada rato deve ser ponderada individualmente, e injetado com 90 mg de pentobarbital kg de peso corporal por (por exemplo, um rato 28 gm seria injetado com 250 mL). </li><li> Injetar no abdômen (IP, intraperitoneal) de um rato grávidas no dia embrionário (E) 9,5 (pode usar outras idades conforme necessário) penetrando a pele e músculo abdominal. Aguarde 8-12 minutos para que o mouse para se tornar não-responsivos. Anestesia adequada deve ser confirmada pela postura relaxada do animal, e falta de movimento em resposta a cauda e pitadas dedo do pé. Suavemente beliscar entre as unhas é altamente sensível, ea falta de qualquer resposta a tais beliscar indica que os animais é suficientemente anestesiados. Nota mesmo os animais que são completamente insensível à pitadas cauda e pés podem algumas vezes se contorcer um pouco, em resposta à incisão cirúrgica inicial. No entanto, esta é uma resposta reflexa e não indica a anestesia inadequada. À base de petróleo bálsamo oftálmica devem ser aplicados para os olhos do mouse para evitar a secagem durante a cirurgia. </li><li> Set-up da área cirúrgica e da máquina de ultra-som enquanto se espera para o mouse para se tornar anestesiados. Como o uso de retrovírus ou lentivírus requer BSL2 de contenção, como dito acima as injeções viral deve ser realizada em um gabinete II Biossegurança. Além disso, todas as soluções e materiais descartáveis ​​que entra em contato com o vírus devem ser descontaminados com uma solução de lixívia a 10%. Os instrumentos cirúrgicos e equipamentos de ultra-som deve ser tratada com uma solução de esterilização, tais como MB-10 ( <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ), ou equivalente utilizado pelo estabelecimento em causa. </li></ol> Parte 3. Exposição dos embriões <ol><li> Se possível (dependendo das restrições da instalação determinado animal e do espaço disponível) é preferível ter a área de preparação cirúrgica em um local separado da área cirúrgica. Isso irá minimizar as chances de contaminação cruzada entre animais. Para iniciar a cirurgia, colocar o animal em sua parte traseira em uma superfície estéril absorvente e lavar a área abdominal completamente com álcool 70%. Tratamentos pré-cirúrgico mais extenso pode ser empregada (por exemplo, sucessivas rodadas de Betadine e lavagens de etanol 70%), mas em nossa experiência isso não é necessário para este tipo de cirurgia a sobrevivência de roedores. Usando uma navalha ponta dupla, raspar o cabelo do abdômen, em uma área de aproximadamente 1 polegada de largura e 1,5 centímetros de comprimento. Use curto movimentos rápidos com a navalha em aproximadamente um ângulo de 45. É importante que a área cirúrgica ser adequadamente tratados, mas não sujeito a molhar em excesso, pois isso pode resultar em refrigeração desnecessário do animal, e, possivelmente, até mesmo a hipotermia. </li><li> Usando muito bem fazer uma tesoura cirúrgica uma incisão &quot;longitudinal através da pele primeiro, e depois através do músculo abdominal do animal (cortando tecido conjuntivo segurando a pele ao músculo vai ajudar com a segunda incisão). Note-se que todo o cuidado procedimento deve ser tomadas para garantir que os instrumentos cirúrgicos permanecem estéreis, eo tratamento com desinfetantes devem ser realizados conforme a necessidade (ou seja, se as dicas de ferramentas entrar em contato com os não-sterile material). </li><li> Forceps usando cuidadosamente tirar cornos uterinos, e registrar o número de embriões em cada lado. Deixando dois embriões expostos adjacentes (seleção dos quais dois dependerá da configuração de cada lado), coloque a maior parte dos cornos uterinos de volta para o animal. Neste contexto, dois embriões serão expostos em um determinado momento e banhado em PBS, enquanto a mãe permanece em suas costas. </li><li> Coloque o animal à sua volta no suporte de acrílico onde será durante a cirurgia (Figura 1A) *. Em seguida, 10 centímetros menor do prato de cultura de tecido ** (que deve ser desinfetado com MB-10 antes de usar) para baixo sobre a mãe, com um par de fórceps colocado um pouco através da membrana verde silastic (feitas usando L RTV silicone base de borracha, e agente de cura; números Dow-Corning produto 3142761 e 2156946, respectivamente). Como você abaixar a placa para baixo sobre o animal, use a pinça para segurar o tecido uterino entre os dois embriões a ser injetado, e puxe-los através da membrana. Ao mesmo tempo, a placa é abaixada até o fim para o titular, e os percevejos são empurrados para segurá-la no lugar. Pré-aquecido (a 37 ° C) PBS é então adicionado ao prato para cobrir completamente os embriões. </li><li> Lugar a fase de injeção contendo o animal e embriões expostos sob a sonda de ultra-som (Figura 1A) para criar imagens em tempo real dos embriões expostos através da parede uterina (Figura 1B). A sonda é então abaixada (usando os controles do motor) para o banho de PBS diretamente sobre os embriões a ser trabalhada. Imagens podem ser obtidas quando a sonda é de aproximadamente 2-3 mm de distância da embriões. É muito importante certificar-se que a sonda não atingiu os embriões, uma vez que oscila para trás e para recolher imagens. </li></ol> * O titular da mãe descansa em durante a cirurgia pode ser facilmente feita por uma oficina mecânica. Ela deve incluir uma base de plexiglass de largura, com dois lados plexiglass colado no topo, e um espaço entre eles (largura suficiente para o mouse para ajustar enquanto deitado de costas). As laterais devem ter um terreno vale fora delas, que é então preenchido com cera negra (por exemplo, a partir de uma bandeja de dissecação). Cera que serve como o material em que thumbtacks será pressionado para segurar o prato de PBS que os embriões são banhadas em durante a injeção. Pratos ** 10 centímetros bacteriana deve ter um buraco (cerca de 2cm de diâmetro) socou para fora do centro da parte inferior (isto pode ser feito com um Heavy Duty perfurador portátil e um dia morrer 13/16 pol circular: <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). Além disso, dois pequenos furos de cada lado do orifício central (cerca de 1,5 cm de distância) deve ser queimado com uma agulha chama-aquecido (ou poderiam ser feitos com uma broca, é claro). Estes buracos são então cobertas com graxa de vácuo e será onde os percevejos que prendem a placa no suporte em empurrar com a cera negra. A graxa de vácuo é evitar que o PBS vaze. Parte 4. Carregando Virus em um Needle microinjeção <ol><li> Forma de uma agulha microinjeção por chanfradura uma 1mm (diâmetro interno) puxou capilar de vidro. A nitidez da agulha é fundamental, e trabalhar com uma agulha afiada insuficiente pode comprometer seriamente a penetração da parede uterina e do saco amniótico, e pode levar ao fracasso experimental. A agulha afiada é então colocado no porta-pipeta, que é ligado através de tubulação para uma micro 25 mL montado em uma bomba de infusão / retirada manual (outros dispositivos podem ser usados ​​para regular a carga e descarga da agulha, mas isso é o que é mostrado no vídeo). Para a capacidade de resposta ideal (para evitar a expansão e compressão associada a um sistema de ar cheia), a micro, tubos e agulhas devem ser preenchidos com óleo mineral. </li><li> Antes de carregar a agulha certifique-se que não há bolhas de ar no sistema da seringa todo o caminho até a ponta da agulha. Em seguida, chamar de volta uma pequena bolha de ar (1-2 mm de comprimento) para dentro da agulha antes de iniciar a carga viral. Esta bolsa de ar ajuda a manter a separação entre o vírus eo óleo mineral. O estoque viral a ser injetado deve conter polibrene na concentração final de 0,08 mg / ml (para mais informações sobre a produção de vírus, por favor consulte as referências 1, 2). Note-se que concentra ações retroviral geralmente contêm uma quantidade significativa de material particulado, que contém a maioria do material infeccioso, e por isso não podem ser filtrados sem a 5 - a queda de 10 vezes no título. Além disso, dependendo da preparação, o estoque viral pode ser viscoso a partir do DNA genômico de células lisadas embalagem (especialmente verdadeiro se utilizando 293 células para gerar MLV / VSV vírus pseudotyped). Se a alíquota de vírus é viscoso, uma pequena quantidade de DNAse I pode e deve ser adicionado ao soltar o estoque, ou carregar a agulha será extremamente difícil. A<html> gota do estoque viral (80-10 mL) deve ser colocado em um pedaço estéril de parafilme em preparação para o carregamento da agulha. Então, usando a bomba de retirada, cuidadosamente carregar a atenção agulha pagar para evitar obstruções. Coloque a agulha carregado na posição micromanipulador na área de injeção, com cuidado para não quebrar a agulha sobre os embriões, ou a sonda de ultra-som. Note que, se por algum motivo a agulha é carregado de forma significativa antes da injeção é a ocorrer, pode ser útil para desenhar uma pequena quantidade de ar na ponta, que pode ser descarregada antes de iniciar as injeções. Esta bolsa de ar pode proteger contra a ação viral de secagem na ponta da agulha (uma ocorrência que quase sempre tornam a agulha carregada inútil). </li></ol> Parte 5. Injeção de ultra-som guiada Viral <ol><li> A imagem em tempo real, criado pela sonda de ultra-som é visualizado no monitor de vídeo, e pode ser usado para guiar a agulha microinjeção no embrião. Usando este sistema de vírus pode ser injetada na bolsa amniótica em E8.5 ou seja o saco amniótico ou o sistema ventricular de E9.5-E11.5 (Figura 1B). Esta é a parte mais difícil do processo e exige uma quantidade significativa de experiência prática para dominar (da ordem de 50-20 horas, dependendo do investigador). A ponta da agulha é evidente na imagem de ultra-som como o ponto mais brilhante na tela, e devem ser vistos se movendo de acordo com os ajustes da posição da sonda (usando os controles do motor no y e z aviões eo controle manual no x plano). É extremamente importante que a direção de oscilação da sonda ser paralela ao comprimento da agulha. Isto irá assegurar que a ponta da agulha permanece no plano de imagem durante os movimentos para posicioná-la para injecção no embrião. </li><li> O embrião deve ser posicionada de tal forma que a região-alvo (neste caso o ventrículo cérebro) é facilmente visível e acessível à agulha com a menor quantidade de material uterino no caminho de injeção. Além disso, é fundamental não para injectar através da placenta. Uma vez que a região do cérebro-alvo é alinhada com a direção de avanço da agulha (usando o botão na micromanipulador), a agulha deve ser apenas tocando a parede uterina, e depois um soco curto rápida para a frente deve penetrar no tecido. Uma abordagem semelhante é usado para penetrar no saco amniótico e depois o cérebro. Em alguns casos, investigador experiente e pode bater o ventrículo em um movimento, especialmente se a agulha é muito afiada. A mecânica do movimento da sonda, a agulha, e os embriões (movendo a mãe no palco), exigem exercícios práticos para dominar. </li><li> Uma vez que o número desejado de embriões foi injetado, perto da parede abdominal com 5,0 suturas de seda. A mecânica de sutura não são específicos para este tipo de cirurgia. Finalmente, use autoclips veterinária para a pele o grampo juntos ao longo dos pontos no músculo abdominal. Sutura da pele não é recomendado porque o rato vai mastigar os pontos. Analgesia deve ser aplicado para a área de incisão para reduzir a quantidade de dor experimentada pelo mouse, uma vez que desperta. Recomenda-se que uma solução de bupivacaína a 0,25% ser injetado (0,8 ml / kg, ou 2 mg / kg) por via subcutânea a cada poucos milímetros ao longo do local da incisão. </li><li> Enquanto o mouse recupera o animal deite cuidadosamente em papel absorvente em uma gaiola limpa contendo um pacote de gel (para facilitar a alimentação e hidratação). Coloque a gaiola em um conjunto de slides mais quente a 37 ° C para manter a temperatura corporal. Quando despertou, coloque o mouse eo pacote de gel em uma gaiola limpa e retornar ao rack animal. </li><li> No dia seguinte, verifique o mouse para qualquer sangramento vaginal, contrações abdominais, e / ou uma olhada geral em dificuldades, todos os quais indicam o aborto. Se este for o caso, euthanize o mouse imediatamente. Cabelos bem arrumados e uma aparência saudável indicam recuperação bem sucedida de uma cirurgia. Os embriões injetados pode ser sacrificado embrionariamente ou após o nascimento para análise posterior. Se o vírus expressa um gene repórter, como a fosfatase alcalina humano (PLAP), ou GFP, a coloração irá revelar as áreas de infecção viral positiva (Figure1C). </li></ol> Resultados representante Embriões injetado pode ser sacrificada 1-2 dias após a injecção todo o caminho até à idade adulta. Se o vírus expressa um gene repórter, como PLAP ou GFP, então repórter expressão serve para identificar células infectadas por vírus e clones dessas células. Por exemplo, mostrado na Figura 1C é uma secção de tecido do cérebro pós-natal que foi infectada no útero em E9.5 com um vetor retroviral PLAP expressar. Células infectadas são visualizados como clusters roxo após coloração histoquímica. Além de identificar células infectadas por vírus, expressão repórter permite analisar a morfologia das células e posição, bem como o status de expressão gênica. nt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Viral injeção nos ventrículos do cérebro anterior E9.5 do mouse. A. O animal anestesiado é colocado no palco da injeção. Dois embriões seriam expostos e colocados sob a sonda de ultra-som no local indicado (seta). A agulha microinjeção cheio de vírus está localizado perto da embriões e alinhados com a sonda de ultra-som. Tela B. captura de uma imagem de ultra-som em tempo real a partir de um embrião de rato E9.5. V, ventrículo; AS, saco amniótico; UW, parede uterina. Os embriões foram injetados C. com um vírus expressando-PLAP em E10.5. Coloração histoquímica para PLAP revela a localização de eventos de infecção viral.

<ol>
	<li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range.">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li><li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Injeções viral usando a orientação de ultra-som pode ser realizado de E8.5-E11.5, onde apenas o saco amniótico pode ser injetado em E8.5, enquanto ambos o saco amniótico e do sistema ventricular pode ser injetado de E9.5-E11.5. Quando realizada corretamente, partículas virais injetada no sistema ventricular usando a orientação de ultra-som têm acesso a as células que revestem o sistema ventricular e, portanto, podem infectar as várias estruturas do (neocórtex, gânglio basal, diencéfalo, olhos, etc) prosencéfalo mesencéfalo, , e rombencéfalo (Figure1C). Vírus injetada no saco amniótico tem acesso às células no exterior do embrião. Além de vírus, a orientação de ultra-som também pode ser usada para injetar as células no embrião em desenvolvimento. Portanto, essa técnica proporciona várias opções para escolher (período de tempo de desenvolvimento, a estrutura do vírus, / células) ao projetar um experimento. É fundamental que o vírus injetado ou células expressam um repórter para uma fácil identificação de células infectadas / injetado. Historicamente, a fosfatase alcalina da placenta humana (PLAP), ou GFP têm sido utilizados. Da experiência, temos encontrado PLAP pode ser um gene repórter muito útil, pois ambos PLAP histoquímica e imunohistoquímica rende uma célula nítida e distinta única mancha que permite analisar a morfologia das células e posição, e realizar uma análise clonal. Já que a expressão GFP viral pode ser fraco, um repórter GFP pode não ser ideal para a coloração dos tecidos, mas é útil quando se quer obter uma única célula por fluorescência separação de células ativadas (FACS).

&quot;Um dos microscópios backscatter seguintes ultra-som pode ser usado para este procedimento. Embora no vídeo a P40 da Paradigm-Medical é usado, o P40 já não é disponível comercialmente, e tem sido substituído pelo P60, que é mesma faixa de preço e pode ser usado para a mesma aplicação. Os materiais adicionais descritos para a construção estágio são para uso com Paradigma Médico-dispositivo (s). O Vevo 2100 vem com equipamentos para geração de imagens de pequenos animais. <ol><li> P60 biomicroscópio ultra-som (UBM) de Paradigma Médico- ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> Vevo 2100 de VisualSonics ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Anestésico e analgésico A solução Nembutal (50 mg de sódio / mL injetável pentobarbital; produzido pelo Laboratório Abbott) podem ser obtidos a partir Bulter Saúde Animal Schein. Note que esta é uma substância controlada II e requer uma Drug Enforcement Agency (DEA) para obter licença. A solução de bupivacaína (0,25%; produzido pela Hospira, Inc., entre outros) podem ser obtidos a partir de um número de distribuidores, incluindo Moore Médica.

ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at e9.5

Cirurgia no útero de sobrevivência em camundongos permite a manipulação molecular de expressão de genes durante o desenvolvimento. No entanto, porque a parede uterina é opaco durante a embriogênese inicial, a capacidade de direcionar partes específicas do embrião para a microinjeção é muito limitada. Felizmente, a alta freqüência ultra-sonografia permite a geração de imagens que podem ser utilizados em tempo real para guiar uma agulha na região microinjeção embrionária de interesse. Aqui nós descrevemos o uso de imagem, para guiar a injeção de vetores retrovirais no sistema ventricular do prosencéfalo mouse no dia embrionário (E) 9.5. Este método usa uma laparotomia para permitir o acesso aos cornos uterinos, e um prato especialmente concebido que permite que embriões de acolhimento para ser banhado em solução salina, enquanto eles são gravadas e injectada. Cirurgias bem sucedidas muitas vezes resultam na maioria ou todos os embriões injetados sobreviver a qualquer ponto do tempo subsequente de juros (embrionariamente ou após o nascimento). Os princípios descritos aqui podem ser usados ​​com pequenas modificações para realizar injeções no líquido amniótico de E8.5 embriões (permitindo assim a infecção ao longo da extensão ântero-posterior do tubo neural, que ainda não tenha fechado), ou no sistema ventricular do cérebro em E10.5/11.5. Além disso, em meados do neurogênica idades (~ E13.5), ultra-sonografia pode ser utilizada injeção direta em regiões específicas do cérebro para a infecção viral ou transplante de células. O uso de ultra-sonografia para guiar em injecções intra-útero em camundongos é uma técnica muito poderosa que permite a manipulação molecular e celular de embriões de ratos de uma forma que de outra forma seria extremamente difícil, senão impossível.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Cirurgia no útero de sobrevivência em camundongos permite a manipulação molecular de expressão de genes durante o desenvolvimento. Aqui nós descrevemos o uso de alta freqüência ultra-sonografia para guiar a injeção de vetores retrovirais para o cérebro do rato no dia embrionário (E) 9.5.

Ultra-som guiada microinjeção em parte frontal do cérebro do rato In Utero Em E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

17.8K visualizações.  Johns Hopkins University School of Medicine. Cirurgia no útero de sobrevivência em camundongos permite a manipulação molecular de expressão de genes durante o desenvolvimento. Aqui nós descrevemos o uso de alta freqüência ultra-sonografia para guiar a injeção de vetores retrovirais para o cérebro do rato no dia embrionário (E) 9.5.

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neurociência

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Microinjeção insulina hipocampal e<em&gt; Em vivo</em&gt; Microdiálise Durante um teste de memória espacial

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...